Imagerie calcique dans Caenorhabditis elegans se comportant librement avec des vibrations bien contrôlées et non localisées
Summary
Il est rapporté ici un système d’imagerie calcique chez Caenorhabditis elegans qui se comporte librement avec des vibrations bien contrôlées et non localisées. Ce système permet aux chercheurs d’évoquer des vibrations non localisées aux propriétés bien contrôlées à l’échelle nanométrique et de quantifier les courants de calcium lors des réponses de C. elegans aux vibrations.
Abstract
Les forces mécaniques non localisées, telles que les vibrations et les ondes acoustiques, influencent une grande variété de processus biologiques, du développement à l’homéostasie. Les animaux font face à ces stimuli en modifiant leur comportement. Comprendre les mécanismes sous-jacents à une telle modification comportementale nécessite la quantification de l’activité neuronale pendant le comportement d’intérêt. Ici, nous rapportons une méthode d’imagerie calcique dans le comportement libre de Caenorhabditis elegans avec des vibrations non localisées de fréquence, de déplacement et de durée spécifiques. Cette méthode permet la production de vibrations bien contrôlées et non localisées à l’aide d’un transducteur acoustique et la quantification des réponses calciques évoquées à une résolution unicellulaire. Comme preuve de principe, la réponse calcique d’un seul interneurone, AVA, lors de la réponse d’échappement de C. elegans aux vibrations est démontrée. Ce système facilitera la compréhension des mécanismes neuronaux sous-jacents aux réponses comportementales aux stimuli mécaniques.
Introduction
Les animaux sont souvent exposés à des stimuli mécaniques non localisés tels que des vibrations ou des ondes acoustiques 1,2. Parce que ces stimuli influencent l’homéostasie, le développement et la reproduction, les animaux doivent modifier leurs comportements pour y faire face 3,4,5. Cependant, les circuits neuronaux et les mécanismes sous-jacents à une telle modification du comportement sont mal compris.
Le comportement mécanosensoriel chez le nématode, Caenorhabditis elegans, est un paradigme comportemental simple, dans lequel les vers changent généralement de comportement d’un mouvement vers l’avant à une réponse d’échappement vers l’arrière lorsqu’ils rencontrent une vibration non localisée6. Le circuit neuronal sous-jacent à ce comportement est composé principalement de cinq neurones sensoriels, de quatre paires d’interneurones et de plusieurs types de motoneurones 7,8. De plus, les vers s’habituent à de tels stimuli mécaniques après un entraînement espacé impliquant une stimulation répétée 9,10,11. Par conséquent, cette réponse comportementale simple constitue un système idéal pour étudier les mécanismes neuronaux sous-jacents à la fois au comportement évoqué par vibration non localisé et à la mémoire. Un protocole d’imagerie calcique chez les vers se comportant librement sous l’influence de vibrations non localisées est illustré. Comparé aux systèmes précédemment signalés, ce système est simple en ce sens qu’il ne nécessite pas de caméra supplémentaire pour le suivi; cependant, cela nous permet de modifier la fréquence, le déplacement et la durée des vibrations non localisées. Étant donné que l’activation des interneurones AVA induit la réponse d’échappement vers l’arrière, les vers co-exprimant GCaMP, un indicateur de calcium, et TagRFP, une protéine fluorescente insensible au calcium, sous le contrôle d’un promoteur spécifique à AVA ont été utilisés comme exemple (voir tableau des matériaux pour plus de détails). Le protocole démontre l’activation des neurones AVA lorsqu’un ver passe d’un mouvement vers l’avant vers l’arrière. Ce protocole facilite la compréhension du mécanisme du circuit neuronal sous-jacent au comportement mécanosensoriel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Généralement, la quantification de l’activité neuronale nécessite l’introduction d’une sonde et/ou de contraintes sur les mouvements du corps animal. Cependant, pour les études du comportement mécanosensoriel, l’introduction invasive d’une sonde et les contentions elles-mêmes constituent des stimuli mécaniques. C. elegans fournit un système pour contourner ces problèmes, parce que ses caractéristiques sont transparentes et parce qu’il a un circuit neuronal simple et compact comprenant seul…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le Caenorhabditis Genetics Center d’avoir fourni les souches utilisées dans cette étude. Cette publication a été soutenue par JSPS KAKENHI Grant-in-Aid for Scientific Research (B) (Grant no. JP18H02483), sur les domaines innovants du projet « Science of Soft Robot » (Grant no. JP18H05474), le PRIME de l’Agence japonaise pour la recherche et le développement médicaux (numéro de subvention 19gm6110022h001) et la fondation Shimadzu.
Materials
| Data anaylsis software | |||
| DualViewImaging.nb | author | For analysis of acquired data | |
| Mathematica12 | Wolfram | For running data anaysis software DualViewImaging | |
| Escherichia coli and C. elegans strains | |||
| E. coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | Food for C. elegans. Uracil auxotroph. E. coli B. |
| lite-1(ce314) strain | Caenorhabditis Genetics Center | KG1180 | Light-insensitive mutant |
| lite-1(ce314) strain expressing NLS-GCaMP-NLS and TagRFP under the control of the AVA-speciric promoter | author | ST12 | lite-1(ce314) mutant carrying the genes expressing NLS-GCaMP5G-NLS (NLS; nuclear localization signal) and TagRFP under the control of the flp-18 promoter as an extrachoromosomal arrays |
| Laser Doppler vibrometer | |||
| Lase Doppler vibrometer | Polytec Japan | IVS-500 | For quantifying frequency and displacement generated by the accoustic transducer |
| Mouse macro system | |||
| Assay.txt | Author | Script for temporally and specially controlling mouse cursol in Windows | |
| HiMacroEx | Vector | https://www.vector.co.jp/download/file/winnt/util/fh667310.html | Free download software for controling mouse cursor based on a script |
| Nematode growth media plate | |||
| Agar purified, powder | Nakarai tesque | 01162-15 | For preparation of NGM plates |
| Bacto pepton | Becton Dickinson | 211677 | For preparation of NGM plates |
| Calcium chloride | Wako | 036-00485 | For preparation of NGM plates |
| Cholesterol | Wako | 034-03002 | For preparation of NGM plates |
| di-Photassium hydrogenphosphate | Nakarai tesque | 28727-95 | For preparation of NGM plates |
| LB broth, Lennox | Nakarai tesque | 20066-95 | For culture of E. coli OP50 |
| Magnesium sulfate anhydrous | TGI | M1890 | For preparation of NGM plates |
| Potassium Dihydrogenphosphate | Nakarai tesque | 28720-65 | For preparation of NGM plates |
| Sodium Chloride | Nakarai tesque | 31320-05 | For preparation of NGM plates |
| Petri dishes (60 mm) | Nunc | 150270 | For preparation of NGM plates |
| Nonlocalized vibration device | |||
| Amplifier | LEPY | LP-A7USB | For stimulation with controllable vibration |
| Acoustic transducer | MinebeaMitsumi | LVC25 | For stimulation with controllable vibration |
| WaveGene Ver. 1.5 | Thrive | http://efu.jp.net/soft/wg/down_wg.html | Free download software for controling vibration property |
| Noninvasive calcium imaging | |||
| 2-Channel benchtop 3-phase brushless DC servo controller | Thorlabs | BBD202 | Compatible controller for MLS203-1 stages |
| 479/585 nm BrightLine dual-band bandpass filter | Semrock | FF01-479/585-25 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| 505/606 nm BrightLine dual-edge standard epi-fluorescence dichroic beamsplitter | Semrock | FF505/606-Di01-25×36 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| 512/25 nm BrightLine single-band bandpass filter | Semrock | FF01-512/25-25 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| 630/92 nm BrightLine single-band bandpass filter | Semrock | FF01-630/92-25 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| Computer | Dell | Precision T7600 | Windows7 with Intel Xeon CPU ES-2630 and 8 GB of RAM |
| High-speed x-y motorized stage | Thorlabs | MLS203-1 | Fast XY scannning stage |
| Image splitting optics | Hamamatsu photonics | A12801-01 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) generated by W-VIEW GEMINI Image spliting optics |
| LED light source | CoolLED | pE-4000 | For generating 470 nm and 560 nm excitation light |
| Microscope | Olympus | MVX10 | |
| sCMOS camera | Andor | Zyla | |
| x 2 Objective lens | Olympus | MVPLAPO2XC | Working distance 20 mm and numerical aperture 0.5 |
| Plasmid | |||
| pKDK66 plasmid | author | pKDK66 | Co-injection marker |
| pTAK83 plasmid | author | pTAK83 | Plasmid for expression of TagRFP under the control of the flp-18 promoter |
| pTAK144 plasmid | author | pTAK144 | Plasmid for expression of NLS-GCaMP5G-NLS under the control of the flp-18 promoter |
| Tracking software | |||
| homingback.vi | author | SubVi file for tracking a fluoresent spot of a worm through feedback control of sCMOS camera and x-y motorized stage | |
| LabVIEW | National instruments | For running tracking software | |
| Zyla Control ver.2.6CI.vi | author | For tracking a fluoresent spot of a worm through feedback control of sCMOS camera and x-y motorized stage |
References
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