הדמיית סידן באלגנים של Caenorhabditis המתנהגים בחופשיות עם רטט מבוקר היטב, שאינו מלוטש
Summary
דווח כאן על מערכת להדמיית סידן בדלקת אלגנס המתנהגת באופן חופשי עם רטט מבוקר היטב, שאינו לוקלי. מערכת זו מאפשרת לחוקרים לעורר תנודות לא-לוקליות בעלות תכונות מבוקרות היטב בתזוזה בקנה מידה ננומטרי ולכמת זרמי סידן במהלך תגובות של C. elegans לתנודות.
Abstract
כוחות מכניים לא-לוקליים, כגון תנודות וגלים אקוסטיים, משפיעים על מגוון רחב של תהליכים ביולוגיים מהתפתחות ועד הומאוסטזיס. בעלי חיים מתמודדים עם גירויים אלה על ידי שינוי התנהגותם. הבנת המנגנונים העומדים בבסיס שינוי התנהגותי כזה דורשת כימות של הפעילות העצבית במהלך התנהגות העניין. כאן, אנו מדווחים על שיטה להדמיית סידן בהתנהגות חופשית של Caenorhabditis elegans עם רטט לא-לוקלי של תדירות, תזוזה ומשך ספציפיים. שיטה זו מאפשרת ייצור של רטט מבוקר היטב, לא-לוקליזציה באמצעות מתמר אקוסטי וכימות של תגובות סידן מעוררות ברזולוציה של תא יחיד. כהוכחה עקרונית, מודגמת תגובת הסידן של אינטרנורון יחיד, AVA, במהלך תגובת הבריחה של C. elegans לרטט. מערכת זו תאפשר הבנה של מנגנונים עצביים העומדים בבסיס התגובות ההתנהגותיות לגירויים מכניים.
Introduction
בעלי חיים נחשפים לעתים קרובות לגירויים מכניים לא לוקליים כגון תנודות או גלים אקוסטיים 1,2. מכיוון שגירויים אלה משפיעים על הומאוסטזיס, התפתחות ורבייה, בעלי חיים חייבים לשנות את התנהגותם כדי להתמודד איתם 3,4,5. עם זאת, המעגלים העצביים והמנגנונים העומדים בבסיס שינוי התנהגותי כזה אינם מובנים היטב.
התנהגות מכנית בנמטודה, Caenorhabditis elegans, היא פרדיגמה התנהגותית פשוטה, שבה תולעים בדרך כלל משנות התנהגות מתנועה קדימה לתגובת בריחה לאחור כאשר הן נתקלות ברטט לא לוקלי6. המעגל העצבי העומד בבסיס התנהגות זו מורכב בעיקר מחמישה נוירונים חושיים, ארבעה זוגות של אינטרנורונים ומספר סוגים של נוירונים מוטוריים 7,8. בנוסף, תולעים רגילות לגירויים מכניים כאלה לאחר אימון מרווח הכולל גירוי חוזרונשנה 9,10,11. לכן, תגובה התנהגותית פשוטה זו מהווה מערכת אידיאלית לחקר מנגנונים עצביים העומדים בבסיס הן התנהגות מעוררת רטט לא-לוקליזציה והן זיכרון. מודגם פרוטוקול להדמיית סידן בתולעים המתנהגות בחופשיות בהשפעת תנודות לא לוקליות. בהשוואה למערכות שדווחו בעבר, מערכת זו פשוטה בכך שהיא אינה דורשת מצלמה נוספת למעקב; עם זאת, הוא מאפשר לנו לשנות את התדירות, התזוזה והמשך של רטט לא-לוקלי. מאחר שהפעלת האינטרנורונים של ה-AVA גורמת לתגובת הבריחה לאחור, תולעים המבטאות במשותף את GCaMP, מחוון סידן, ו-TagRFP, חלבון פלואורסצנטי חסר רגישות לסידן, תחת שליטתו של מקדם ספציפי ל-AVA שימשו כדוגמה (ראו טבלת חומרים לפרטים). הפרוטוקול מדגים את ההפעלה של נוירוני AVA כאשר תולעת עוברת מתנועה קדימה לתנועה לאחור. פרוטוקול זה מאפשר להבין את מנגנון המעגל העצבי העומד בבסיס ההתנהגות המכנוזנסורית.
Protocol
Representative Results
Discussion
באופן כללי, כימות הפעילות העצבית דורש הכנסת בדיקה ו/או ריסון על תנועת גוף בעלי החיים. עם זאת, עבור מחקרים על התנהגות מכנית, ההקדמה הפולשנית של בדיקה ומעצורים עצמם מהווים גירויים מכניים. C. elegans מספק מערכת לעקיפת בעיות אלה, משום שתכונותיו שקופות ומשום שיש לו מעגל עצבי פשוט וקומפקטי הכולל …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים למרכז הגנטיקה של Caenorhabditis על אספקת הזנים המשמשים במחקר זה. פרסום זה נתמך על ידי JSPS KAKENHI מענק-סיוע למחקר מדעי (B) (מענק מס’ JP18H02483), על תחומים חדשניים “מדע הרובוט הרך” פרויקט (מענק מס’ JP18H05474), ראש הממשלה מהסוכנות היפנית למחקר ופיתוח רפואי (מענק מספר 19gm6110022h001), וקרן שימאדזו.
Materials
| Data anaylsis software | |||
| DualViewImaging.nb | author | For analysis of acquired data | |
| Mathematica12 | Wolfram | For running data anaysis software DualViewImaging | |
| Escherichia coli and C. elegans strains | |||
| E. coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | Food for C. elegans. Uracil auxotroph. E. coli B. |
| lite-1(ce314) strain | Caenorhabditis Genetics Center | KG1180 | Light-insensitive mutant |
| lite-1(ce314) strain expressing NLS-GCaMP-NLS and TagRFP under the control of the AVA-speciric promoter | author | ST12 | lite-1(ce314) mutant carrying the genes expressing NLS-GCaMP5G-NLS (NLS; nuclear localization signal) and TagRFP under the control of the flp-18 promoter as an extrachoromosomal arrays |
| Laser Doppler vibrometer | |||
| Lase Doppler vibrometer | Polytec Japan | IVS-500 | For quantifying frequency and displacement generated by the accoustic transducer |
| Mouse macro system | |||
| Assay.txt | Author | Script for temporally and specially controlling mouse cursol in Windows | |
| HiMacroEx | Vector | https://www.vector.co.jp/download/file/winnt/util/fh667310.html | Free download software for controling mouse cursor based on a script |
| Nematode growth media plate | |||
| Agar purified, powder | Nakarai tesque | 01162-15 | For preparation of NGM plates |
| Bacto pepton | Becton Dickinson | 211677 | For preparation of NGM plates |
| Calcium chloride | Wako | 036-00485 | For preparation of NGM plates |
| Cholesterol | Wako | 034-03002 | For preparation of NGM plates |
| di-Photassium hydrogenphosphate | Nakarai tesque | 28727-95 | For preparation of NGM plates |
| LB broth, Lennox | Nakarai tesque | 20066-95 | For culture of E. coli OP50 |
| Magnesium sulfate anhydrous | TGI | M1890 | For preparation of NGM plates |
| Potassium Dihydrogenphosphate | Nakarai tesque | 28720-65 | For preparation of NGM plates |
| Sodium Chloride | Nakarai tesque | 31320-05 | For preparation of NGM plates |
| Petri dishes (60 mm) | Nunc | 150270 | For preparation of NGM plates |
| Nonlocalized vibration device | |||
| Amplifier | LEPY | LP-A7USB | For stimulation with controllable vibration |
| Acoustic transducer | MinebeaMitsumi | LVC25 | For stimulation with controllable vibration |
| WaveGene Ver. 1.5 | Thrive | http://efu.jp.net/soft/wg/down_wg.html | Free download software for controling vibration property |
| Noninvasive calcium imaging | |||
| 2-Channel benchtop 3-phase brushless DC servo controller | Thorlabs | BBD202 | Compatible controller for MLS203-1 stages |
| 479/585 nm BrightLine dual-band bandpass filter | Semrock | FF01-479/585-25 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| 505/606 nm BrightLine dual-edge standard epi-fluorescence dichroic beamsplitter | Semrock | FF505/606-Di01-25×36 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| 512/25 nm BrightLine single-band bandpass filter | Semrock | FF01-512/25-25 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| 630/92 nm BrightLine single-band bandpass filter | Semrock | FF01-630/92-25 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| Computer | Dell | Precision T7600 | Windows7 with Intel Xeon CPU ES-2630 and 8 GB of RAM |
| High-speed x-y motorized stage | Thorlabs | MLS203-1 | Fast XY scannning stage |
| Image splitting optics | Hamamatsu photonics | A12801-01 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) generated by W-VIEW GEMINI Image spliting optics |
| LED light source | CoolLED | pE-4000 | For generating 470 nm and 560 nm excitation light |
| Microscope | Olympus | MVX10 | |
| sCMOS camera | Andor | Zyla | |
| x 2 Objective lens | Olympus | MVPLAPO2XC | Working distance 20 mm and numerical aperture 0.5 |
| Plasmid | |||
| pKDK66 plasmid | author | pKDK66 | Co-injection marker |
| pTAK83 plasmid | author | pTAK83 | Plasmid for expression of TagRFP under the control of the flp-18 promoter |
| pTAK144 plasmid | author | pTAK144 | Plasmid for expression of NLS-GCaMP5G-NLS under the control of the flp-18 promoter |
| Tracking software | |||
| homingback.vi | author | SubVi file for tracking a fluoresent spot of a worm through feedback control of sCMOS camera and x-y motorized stage | |
| LabVIEW | National instruments | For running tracking software | |
| Zyla Control ver.2.6CI.vi | author | For tracking a fluoresent spot of a worm through feedback control of sCMOS camera and x-y motorized stage |
References
- Hill, P. S. M., Wessel, A. Biotremology. Current Biology. 26 (5), 187-191 (2016).
- Fettiplace, R., Hackney, C. M. The sensory and motor roles of auditory hair cells. Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 19-29 (2006).
- Vogel, V., Sheetz, M. Local force and geometry sensing regulate cell functions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (4), 265-275 (2006).
- Katta, S., Krieg, M., Goodman, M. B. Feeling force: physical and physiological principles enabling sensory mechanotransduction. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31, 347-371 (2015).
- Orr, A. W., Helmke, B. P., Blackman, B. R., Schwartz, M. A. Mechanisms of mechanotransduction. Developmental Cell. 10 (1), 11-20 (2006).
- Goodman, M. B., Sengupta, P. How Caenorhabditis elegans senses mechanical stress, temperature, and other physical stimuli. 유전학. 212 (1), 25-51 (2019).
- Chalfie, M., et al. The neural circuit for touch sensitivity in Caenorhabditis elegans. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 5 (4), 956-964 (1985).
- Wicks, S. R., Rankin, C. H. The integration of antagonistic reflexes revealed by laser ablation of identified neurons determines habituation kinetics of the Caenorhabditis elegans tap withdrawal response. Journal of Comparative Physiology. A Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 179 (5), 675-685 (1996).
- Rankin, C. H., Beck, C. D., Chiba, C. M. Caenorhabditis elegans: a new model system for the study of learning and memory. Behavioural Brain Research. 37 (1), 89-92 (1990).
- Bozorgmehr, T., Ardiel, E. L., McEwan, A. H., Rankin, C. H. Mechanisms of plasticity in a Caenorhabditis elegans mechanosensory circuit. Frontiers in Physiology. 4, 88 (2013).
- Sugi, T., Ohtani, Y., Kumiya, Y., Igarashi, R., Shirakawa, M. High-throughput optical quantification of mechanosensory habituation reveals neurons encoding memory in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (48), 17236-17241 (2014).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Sugi, T., Okumura, E., Kiso, K., Igarashi, R. Nanoscale mechanical stimulation method for quantifying C. elegans mechanosensory behavior and memory. Analytical Sciences: The International Journal of the Japan Society for Analytical Chemistry. 32 (11), 1159-1164 (2016).
- Brownell, P. H. Compressional and surface waves in sand: used by desert scorpions to locate prey. Science. 197 (4302), 479-482 (1977).
- Clark, D. A., Gabel, C. V., Gabel, H., Samuel, A. D. T. Temporal activity patterns in thermosensory neurons of freely moving Caenorhabditis elegans encode spatial thermal gradients. Journal of Neuroscience. 27 (23), 6083-6090 (2007).
- Tsukada, Y., et al. Reconstruction of spatial thermal gradient encoded in thermosensory neuron AFD in Caenorhabditis elegans. Journal of Neuroscience. 36 (9), 2571-2581 (2016).
- Piggott, B. J., Liu, J., Feng, Z., Wescott, S. A., Xu, X. Z. S. The neural circuits and synaptic mechanisms underlying motor initiation in C. elegans. Cell. 147 (4), 922-933 (2011).
- Nguyen, J. P., et al. Whole-brain calcium imaging with cellular resolution in freely behaving Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), 1074-1081 (2016).
- Schrodel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light. Nature Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).
- Prevedel, R., et al. Simultaneous whole-animal 3D imaging of neuronal activity using light-field microscopy. Nature Methods. 11, 727-730 (2014).
- Nichols, A. L. A., Eichler, T., Latham, R., Zimmer, M. A global brain state underlies C. elegans sleep behavior. Science. 356 (6344), (2017).
- Zheng, M., Cao, P., Yang, J., Xu, X. Z. S., Feng, Z. Calcium imaging of multiple neurons in freely behaving C. elegans. Journal of Neuroscience Methods. 206 (1), 78-82 (2012).
- Sugi, T., Ito, H., Nishimura, M., Nagai, K. H. C. elegans collectively forms dynamical networks. Nature Communications. 10 (1), 1-9 (2019).
