Imaging del calcio in Caenorhabditis elegans che si comporta liberamente con vibrazioni ben controllate e non localizzate
Summary
Qui è riportato un sistema per l’imaging del calcio nel comportamento libero di Caenorhabditis elegans con vibrazioni ben controllate e non localizzate. Questo sistema consente ai ricercatori di evocare vibrazioni non localizzate con proprietà ben controllate a spostamento su scala nanometrica e di quantificare le correnti di calcio durante le risposte di C. elegans alle vibrazioni.
Abstract
Le forze meccaniche non localizzate, come le vibrazioni e le onde acustiche, influenzano un’ampia varietà di processi biologici dallo sviluppo all’omeostasi. Gli animali affrontano questi stimoli modificando il loro comportamento. Comprendere i meccanismi alla base di tale modifica comportamentale richiede la quantificazione dell’attività neurale durante il comportamento di interesse. Qui, riportiamo un metodo per l’imaging del calcio nel comportamento libero caenorhabditis elegans con vibrazione non localizzata di frequenza, spostamento e durata specifici. Questo metodo consente la produzione di vibrazioni ben controllate e non localizzate utilizzando un trasduttore acustico e la quantificazione delle risposte calciche evocate a risoluzione a singola cellula. Come prova di principio, viene dimostrata la risposta al calcio di un singolo interneurone, AVA, durante la risposta di fuga di C. elegans alle vibrazioni. Questo sistema faciliterà la comprensione dei meccanismi neurali alla base delle risposte comportamentali agli stimoli meccanici.
Introduction
Gli animali sono spesso esposti a stimoli meccanici non localizzati come vibrazioni o onde acustiche 1,2. Poiché questi stimoli influenzano l’omeostasi, lo sviluppo e la riproduzione, gli animali devono modificare i loro comportamenti per affrontarli 3,4,5. Tuttavia, i circuiti neurali e i meccanismi alla base di tale modifica comportamentale sono poco compresi.
Il comportamento meccanosensoriale nel nematode, Caenorhabditis elegans, è un semplice paradigma comportamentale, in cui i vermi di solito cambiano comportamento dal movimento in avanti a una risposta di fuga all’indietro quando incontrano la vibrazione non localizzata6. Il circuito neurale alla base di questo comportamento è composto principalmente da cinque neuroni sensoriali, quattro coppie di interneuroni e diversi tipi di motoneuroni 7,8. Inoltre, i vermi si abituano a tali stimoli meccanici dopo un allenamento distanziato che comporta una stimolazione ripetuta 9,10,11. Pertanto, questa semplice risposta comportamentale costituisce un sistema ideale per studiare i meccanismi neurali alla base sia del comportamento evocato dalla vibrazione non localizzata che della memoria. Viene illustrato un protocollo per l’imaging del calcio in vermi che si comportano liberamente sotto l’influenza di vibrazioni non localizzate. Rispetto ai sistemi precedentemente segnalati, questo sistema è semplice in quanto non richiede una telecamera aggiuntiva per il tracciamento; tuttavia, ci consente di modificare la frequenza, lo spostamento e la durata della vibrazione non localizzata. Poiché l’attivazione degli interneuroni AVA induce la risposta di fuga all’indietro, i vermi che co-esprimono GCaMP, un indicatore di calcio, e TagRFP, una proteina fluorescente insensibile al calcio, sotto il controllo di un promotore specifico dell’AVA sono stati usati come esempio (vedi Tabella dei materiali per i dettagli). Il protocollo dimostra l’attivazione dei neuroni AVA mentre un worm passa dal movimento in avanti a quello all’indietro. Questo protocollo facilita la comprensione del meccanismo del circuito neurale alla base del comportamento meccanosensoriale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Generalmente, la quantificazione dell’attività neurale richiede l’introduzione di una sonda e/o restrizioni sul movimento del corpo animale. Tuttavia, per gli studi sul comportamento meccanosensoriale, l’introduzione invasiva di una sonda e le restrizioni stesse costituiscono stimoli meccanici. C. elegans fornisce un sistema per aggirare questi problemi, perché le sue caratteristiche sono trasparenti e perché ha un circuito neurale semplice e compatto che comprende solo 302 neuroni. Combinando questi vantaggi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il Caenorhabditis Genetics Center per aver fornito i ceppi utilizzati in questo studio. Questa pubblicazione è stata sostenuta da JSPS KAKENHI Grant-in-Aid for Scientific research (B) (Grant no. JP18H02483), sul progetto “Science of Soft Robot” delle aree innovative (Grant no. JP18H05474), il PRIME dell’Agenzia giapponese per la ricerca e lo sviluppo medico (numero di sovvenzione 19gm6110022h001) e la fondazione Shimadzu.
Materials
| Data anaylsis software | |||
| DualViewImaging.nb | author | For analysis of acquired data | |
| Mathematica12 | Wolfram | For running data anaysis software DualViewImaging | |
| Escherichia coli and C. elegans strains | |||
| E. coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | Food for C. elegans. Uracil auxotroph. E. coli B. |
| lite-1(ce314) strain | Caenorhabditis Genetics Center | KG1180 | Light-insensitive mutant |
| lite-1(ce314) strain expressing NLS-GCaMP-NLS and TagRFP under the control of the AVA-speciric promoter | author | ST12 | lite-1(ce314) mutant carrying the genes expressing NLS-GCaMP5G-NLS (NLS; nuclear localization signal) and TagRFP under the control of the flp-18 promoter as an extrachoromosomal arrays |
| Laser Doppler vibrometer | |||
| Lase Doppler vibrometer | Polytec Japan | IVS-500 | For quantifying frequency and displacement generated by the accoustic transducer |
| Mouse macro system | |||
| Assay.txt | Author | Script for temporally and specially controlling mouse cursol in Windows | |
| HiMacroEx | Vector | https://www.vector.co.jp/download/file/winnt/util/fh667310.html | Free download software for controling mouse cursor based on a script |
| Nematode growth media plate | |||
| Agar purified, powder | Nakarai tesque | 01162-15 | For preparation of NGM plates |
| Bacto pepton | Becton Dickinson | 211677 | For preparation of NGM plates |
| Calcium chloride | Wako | 036-00485 | For preparation of NGM plates |
| Cholesterol | Wako | 034-03002 | For preparation of NGM plates |
| di-Photassium hydrogenphosphate | Nakarai tesque | 28727-95 | For preparation of NGM plates |
| LB broth, Lennox | Nakarai tesque | 20066-95 | For culture of E. coli OP50 |
| Magnesium sulfate anhydrous | TGI | M1890 | For preparation of NGM plates |
| Potassium Dihydrogenphosphate | Nakarai tesque | 28720-65 | For preparation of NGM plates |
| Sodium Chloride | Nakarai tesque | 31320-05 | For preparation of NGM plates |
| Petri dishes (60 mm) | Nunc | 150270 | For preparation of NGM plates |
| Nonlocalized vibration device | |||
| Amplifier | LEPY | LP-A7USB | For stimulation with controllable vibration |
| Acoustic transducer | MinebeaMitsumi | LVC25 | For stimulation with controllable vibration |
| WaveGene Ver. 1.5 | Thrive | http://efu.jp.net/soft/wg/down_wg.html | Free download software for controling vibration property |
| Noninvasive calcium imaging | |||
| 2-Channel benchtop 3-phase brushless DC servo controller | Thorlabs | BBD202 | Compatible controller for MLS203-1 stages |
| 479/585 nm BrightLine dual-band bandpass filter | Semrock | FF01-479/585-25 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| 505/606 nm BrightLine dual-edge standard epi-fluorescence dichroic beamsplitter | Semrock | FF505/606-Di01-25×36 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| 512/25 nm BrightLine single-band bandpass filter | Semrock | FF01-512/25-25 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| 630/92 nm BrightLine single-band bandpass filter | Semrock | FF01-630/92-25 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| Computer | Dell | Precision T7600 | Windows7 with Intel Xeon CPU ES-2630 and 8 GB of RAM |
| High-speed x-y motorized stage | Thorlabs | MLS203-1 | Fast XY scannning stage |
| Image splitting optics | Hamamatsu photonics | A12801-01 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) generated by W-VIEW GEMINI Image spliting optics |
| LED light source | CoolLED | pE-4000 | For generating 470 nm and 560 nm excitation light |
| Microscope | Olympus | MVX10 | |
| sCMOS camera | Andor | Zyla | |
| x 2 Objective lens | Olympus | MVPLAPO2XC | Working distance 20 mm and numerical aperture 0.5 |
| Plasmid | |||
| pKDK66 plasmid | author | pKDK66 | Co-injection marker |
| pTAK83 plasmid | author | pTAK83 | Plasmid for expression of TagRFP under the control of the flp-18 promoter |
| pTAK144 plasmid | author | pTAK144 | Plasmid for expression of NLS-GCaMP5G-NLS under the control of the flp-18 promoter |
| Tracking software | |||
| homingback.vi | author | SubVi file for tracking a fluoresent spot of a worm through feedback control of sCMOS camera and x-y motorized stage | |
| LabVIEW | National instruments | For running tracking software | |
| Zyla Control ver.2.6CI.vi | author | For tracking a fluoresent spot of a worm through feedback control of sCMOS camera and x-y motorized stage |
References
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