自由に行動する カエノルハブディティス・エレガンス におけるカルシウムイメージングと、十分に制御された非局在振動
1Program of Biomedical Science, Graduate School of Integrated Sciences for Life,Hiroshima University, 2Institute for Quantum Life Science,National Institute for Quantum and Radiological Science and Technology, 3National Institute for Radiological Sciences,National Institute for Quantum and Radiological Science and Technology, 4JST, PRESTO
Summary
ここで報告されたのは、よく制御された非局在振動を有する 自由に行動するCaenorhabditis elegans におけるカルシウムイメージングのためのシステムである。このシステムにより、研究者はナノスケールの変位で十分に制御された特性を持つ非局在振動を呼び起こし、振動に対する C. elegans の応答中のカルシウム電流を定量化することができます。
Abstract
振動や音波などの非局在的な機械的力は、発生から恒常性まで、さまざまな生物学的プロセスに影響を与えます。動物は行動を変えることによってこれらの刺激に対処します。このような行動修正の根底にあるメカニズムを理解するには、関心のある行動中の神経活動の定量化が必要です。ここでは、特定の周波数、変位、および持続時間の非局在振動を有する カエノラブディティス・エレガンス を自由に行動させる際のカルシウムイメージングの方法を報告する。この方法は、音響トランスデューサを使用して十分に制御された非局在振動を生成し、単一細胞分解能で誘発されたカルシウム応答を定量化することを可能にする。原理の証明として、振動に対する C.エレガンスの 脱出応答の間、単一の介在ニューロンAVAのカルシウム応答が実証される。このシステムは、機械的刺激に対する行動応答の根底にある神経メカニズムの理解を容易にする。
Introduction
動物はしばしば、振動や音響波などの非局在的な機械的刺激にさらされる1,2。これらの刺激は恒常性、発達、生殖に影響を与えるため、動物はそれらに対処するために行動を変えなければなりません3,4,5。しかし、そのような行動改変の根底にある神経回路およびメカニズムは、ほとんど理解されていない。
線虫のメカノセンティック行動、Caenorhabditis elegansは単純な行動パラダイムであり、ワームは通常、非局在的な振動に遭遇すると、前方の動きから後方の脱出応答に行動を変える6。この挙動の根底にある神経回路は、主に5つの感覚ニューロン、4対の介在ニューロン、および数種類の運動ニューロン7、8から構成される。さらに、ワームは、反復刺激9、10、11を含む間隔をあけた訓練の後、そのような機械的刺激に慣れる。したがって、この単純な行動応答は、非局在的な振動誘発行動と記憶の両方の根底にある神経メカニズムを調査するための理想的なシステムを構成する。非局在振動の影響下で自由に行動するワームにおけるカルシウムイメージングのためのプロトコルが示されている。以前に報告されたシステムと比較して、このシステムは追跡のために追加のカメラを必要としないという点で簡単です。ただし、非局在振動の周波数、変位、および持続時間を変更することができます。AVA介在ニューロンの活性化は後方脱出応答を誘導するため、AVA特異的プロモーターの制御下でカルシウム指示薬GCaMPとカルシウム非感受性蛍光タンパク質TagRFPを共発現するワームを例に挙げた(詳細は材料表参照)。このプロトコルは、ワームが前方から後方への移動に切り替える際のAVAニューロンの活性化を示しています。このプロトコルは、メカノ感覚行動の根底にある神経回路メカニズムの理解を容易にする。
Protocol
1. カルシウムイメージングまでのワームの培養 カルシウムイメージング実験の4日前に、2匹の成虫ST12ワームを、エシェリヒア・コリOP50が正方形のパターン(約4mm x 4mm)に縞模様になっている新しい線虫増殖培地(材料表)に移し、細胞スプレッダーを用いて、ワームがカルシウムイメージング中に細菌にほとんどの時間を費やすようにする12。 …
Representative Results
ここでは、AVAインターニューロン特異的プロモーターの制御下でGCaMPとTagRFPの両方を発現するワームを、自由に振る舞う C.エレガンスにおけるカルシウムイメージングの一例として用いている。GCaMPおよびTagRFPチャネルデータは、一連の画像として得られ、その一部は 図6 およびムービーとして示されている(補足ムービー1)。当社の非局在振動システ?…
Discussion
一般に、神経活動の定量化には、プローブの導入および/または動物の身体運動に対する拘束が必要である。しかし、機械感覚行動の研究のために、プローブおよび拘束の侵襲的な導入自体が機械的刺激を構成する。 C. elegansは 、その特徴が透明であり、302個のニューロンのみからなる単純でコンパクトな神経回路を有するため、これらの問題を回避するシステムを提供する。これらの…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、この研究で使用された株を提供してくれた Caenorhabditis Genetics Centerに感謝する。本誌は、日本学術振興会科学研究費補助金(基盤研究(B)の助成を受けて行われました(Grant no.JP18H02483)、革新的領域「ソフトロボットの科学」プロジェクト(助成金番号。JP18H05474)、国立研究開発法人日本医療研究開発機構(助成番号19gm6110022h001)、島津製作所よりPRIMEを運営。
Materials
| Data anaylsis software | |||
| DualViewImaging.nb | author | For analysis of acquired data | |
| Mathematica12 | Wolfram | For running data anaysis software DualViewImaging | |
| Escherichia coli and C. elegans strains | |||
| E. coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | Food for C. elegans. Uracil auxotroph. E. coli B. |
| lite-1(ce314) strain | Caenorhabditis Genetics Center | KG1180 | Light-insensitive mutant |
| lite-1(ce314) strain expressing NLS-GCaMP-NLS and TagRFP under the control of the AVA-speciric promoter | author | ST12 | lite-1(ce314) mutant carrying the genes expressing NLS-GCaMP5G-NLS (NLS; nuclear localization signal) and TagRFP under the control of the flp-18 promoter as an extrachoromosomal arrays |
| Laser Doppler vibrometer | |||
| Lase Doppler vibrometer | Polytec Japan | IVS-500 | For quantifying frequency and displacement generated by the accoustic transducer |
| Mouse macro system | |||
| Assay.txt | Author | Script for temporally and specially controlling mouse cursol in Windows | |
| HiMacroEx | Vector | https://www.vector.co.jp/download/file/winnt/util/fh667310.html | Free download software for controling mouse cursor based on a script |
| Nematode growth media plate | |||
| Agar purified, powder | Nakarai tesque | 01162-15 | For preparation of NGM plates |
| Bacto pepton | Becton Dickinson | 211677 | For preparation of NGM plates |
| Calcium chloride | Wako | 036-00485 | For preparation of NGM plates |
| Cholesterol | Wako | 034-03002 | For preparation of NGM plates |
| di-Photassium hydrogenphosphate | Nakarai tesque | 28727-95 | For preparation of NGM plates |
| LB broth, Lennox | Nakarai tesque | 20066-95 | For culture of E. coli OP50 |
| Magnesium sulfate anhydrous | TGI | M1890 | For preparation of NGM plates |
| Potassium Dihydrogenphosphate | Nakarai tesque | 28720-65 | For preparation of NGM plates |
| Sodium Chloride | Nakarai tesque | 31320-05 | For preparation of NGM plates |
| Petri dishes (60 mm) | Nunc | 150270 | For preparation of NGM plates |
| Nonlocalized vibration device | |||
| Amplifier | LEPY | LP-A7USB | For stimulation with controllable vibration |
| Acoustic transducer | MinebeaMitsumi | LVC25 | For stimulation with controllable vibration |
| WaveGene Ver. 1.5 | Thrive | http://efu.jp.net/soft/wg/down_wg.html | Free download software for controling vibration property |
| Noninvasive calcium imaging | |||
| 2-Channel benchtop 3-phase brushless DC servo controller | Thorlabs | BBD202 | Compatible controller for MLS203-1 stages |
| 479/585 nm BrightLine dual-band bandpass filter | Semrock | FF01-479/585-25 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| 505/606 nm BrightLine dual-edge standard epi-fluorescence dichroic beamsplitter | Semrock | FF505/606-Di01-25×36 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| 512/25 nm BrightLine single-band bandpass filter | Semrock | FF01-512/25-25 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| 630/92 nm BrightLine single-band bandpass filter | Semrock | FF01-630/92-25 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| Computer | Dell | Precision T7600 | Windows7 with Intel Xeon CPU ES-2630 and 8 GB of RAM |
| High-speed x-y motorized stage | Thorlabs | MLS203-1 | Fast XY scannning stage |
| Image splitting optics | Hamamatsu photonics | A12801-01 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) generated by W-VIEW GEMINI Image spliting optics |
| LED light source | CoolLED | pE-4000 | For generating 470 nm and 560 nm excitation light |
| Microscope | Olympus | MVX10 | |
| sCMOS camera | Andor | Zyla | |
| x 2 Objective lens | Olympus | MVPLAPO2XC | Working distance 20 mm and numerical aperture 0.5 |
| Plasmid | |||
| pKDK66 plasmid | author | pKDK66 | Co-injection marker |
| pTAK83 plasmid | author | pTAK83 | Plasmid for expression of TagRFP under the control of the flp-18 promoter |
| pTAK144 plasmid | author | pTAK144 | Plasmid for expression of NLS-GCaMP5G-NLS under the control of the flp-18 promoter |
| Tracking software | |||
| homingback.vi | author | SubVi file for tracking a fluoresent spot of a worm through feedback control of sCMOS camera and x-y motorized stage | |
| LabVIEW | National instruments | For running tracking software | |
| Zyla Control ver.2.6CI.vi | author | For tracking a fluoresent spot of a worm through feedback control of sCMOS camera and x-y motorized stage |
References
- Hill, P. S. M., Wessel, A. Biotremology. Current Biology. 26 (5), 187-191 (2016).
- Fettiplace, R., Hackney, C. M. The sensory and motor roles of auditory hair cells. Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 19-29 (2006).
- Vogel, V., Sheetz, M. Local force and geometry sensing regulate cell functions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (4), 265-275 (2006).
- Katta, S., Krieg, M., Goodman, M. B. Feeling force: physical and physiological principles enabling sensory mechanotransduction. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31, 347-371 (2015).
- Orr, A. W., Helmke, B. P., Blackman, B. R., Schwartz, M. A. Mechanisms of mechanotransduction. Developmental Cell. 10 (1), 11-20 (2006).
- Goodman, M. B., Sengupta, P. How Caenorhabditis elegans senses mechanical stress, temperature, and other physical stimuli. 유전학. 212 (1), 25-51 (2019).
- Chalfie, M., et al. The neural circuit for touch sensitivity in Caenorhabditis elegans. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 5 (4), 956-964 (1985).
- Wicks, S. R., Rankin, C. H. The integration of antagonistic reflexes revealed by laser ablation of identified neurons determines habituation kinetics of the Caenorhabditis elegans tap withdrawal response. Journal of Comparative Physiology. A Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 179 (5), 675-685 (1996).
- Rankin, C. H., Beck, C. D., Chiba, C. M. Caenorhabditis elegans: a new model system for the study of learning and memory. Behavioural Brain Research. 37 (1), 89-92 (1990).
- Bozorgmehr, T., Ardiel, E. L., McEwan, A. H., Rankin, C. H. Mechanisms of plasticity in a Caenorhabditis elegans mechanosensory circuit. Frontiers in Physiology. 4, 88 (2013).
- Sugi, T., Ohtani, Y., Kumiya, Y., Igarashi, R., Shirakawa, M. High-throughput optical quantification of mechanosensory habituation reveals neurons encoding memory in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (48), 17236-17241 (2014).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Sugi, T., Okumura, E., Kiso, K., Igarashi, R. Nanoscale mechanical stimulation method for quantifying C. elegans mechanosensory behavior and memory. Analytical Sciences: The International Journal of the Japan Society for Analytical Chemistry. 32 (11), 1159-1164 (2016).
- Brownell, P. H. Compressional and surface waves in sand: used by desert scorpions to locate prey. Science. 197 (4302), 479-482 (1977).
- Clark, D. A., Gabel, C. V., Gabel, H., Samuel, A. D. T. Temporal activity patterns in thermosensory neurons of freely moving Caenorhabditis elegans encode spatial thermal gradients. Journal of Neuroscience. 27 (23), 6083-6090 (2007).
- Tsukada, Y., et al. Reconstruction of spatial thermal gradient encoded in thermosensory neuron AFD in Caenorhabditis elegans. Journal of Neuroscience. 36 (9), 2571-2581 (2016).
- Piggott, B. J., Liu, J., Feng, Z., Wescott, S. A., Xu, X. Z. S. The neural circuits and synaptic mechanisms underlying motor initiation in C. elegans. Cell. 147 (4), 922-933 (2011).
- Nguyen, J. P., et al. Whole-brain calcium imaging with cellular resolution in freely behaving Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), 1074-1081 (2016).
- Schrodel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light. Nature Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).
- Prevedel, R., et al. Simultaneous whole-animal 3D imaging of neuronal activity using light-field microscopy. Nature Methods. 11, 727-730 (2014).
- Nichols, A. L. A., Eichler, T., Latham, R., Zimmer, M. A global brain state underlies C. elegans sleep behavior. Science. 356 (6344), (2017).
- Zheng, M., Cao, P., Yang, J., Xu, X. Z. S., Feng, Z. Calcium imaging of multiple neurons in freely behaving C. elegans. Journal of Neuroscience Methods. 206 (1), 78-82 (2012).
- Sugi, T., Ito, H., Nishimura, M., Nagai, K. H. C. elegans collectively forms dynamical networks. Nature Communications. 10 (1), 1-9 (2019).
Cite This Article
Shigyou, K., Maeoka, H., Igarashi, R., Sugi, T. Calcium Imaging in Freely Behaving Caenorhabditis elegans with Well-Controlled, Nonlocalized Vibration. J. Vis. Exp. (170), e61626, doi:10.3791/61626 (2021).