Kalsiumavbildning i fritt oppførende caenorhabditt elegans med godt kontrollert, ikke-lokalisert vibrasjon
Summary
Rapportert her er et system for kalsiumavbildning i fritt oppføre Caenorhabditis elegans med godt kontrollert, ikke-lokalisert vibrasjon. Dette systemet gjør det mulig for forskere å fremkalle ikke-lokaliserte vibrasjoner med godt kontrollerte egenskaper ved nanoskala forskyvning og å kvantifisere kalsiumstrømmer under respons av C. elegans til vibrasjonene.
Abstract
Ikke-lokaliserte mekaniske krefter, som vibrasjoner og akustiske bølger, påvirker et bredt spekter av biologiske prosesser fra utvikling til homeostase. Dyr takler disse stimuliene ved å endre deres oppførsel. Å forstå mekanismene som ligger til grunn for en slik atferdsendring krever kvantifisering av nevral aktivitet under oppførselen av interesse. Her rapporterer vi en metode for kalsiumavbildning i fritt oppførende Caenorhabditis elegans med ikke-lokalisert vibrasjon av spesifikk frekvens, forskyvning og varighet. Denne metoden tillater produksjon av godt kontrollert, ikke-lokalisert vibrasjon ved hjelp av en akustisk svinger og kvantifisering av fremkalte kalsiumresponser ved encellet oppløsning. Som et prinsippbevis demonstreres kalsiumresponsen til en enkelt internuron, AVA, under Rømmingsresponsen fra C. elegans til vibrasjon. Dette systemet vil lette forståelsen av nevrale mekanismer som ligger til grunn for atferdsresponser på mekaniske stimuli.
Introduction
Dyr blir ofte utsatt for ikke-lokaliserte mekaniske stimuli som vibrasjoner eller akustiske bølger 1,2. Fordi disse stimuliene påvirker homeostase, utvikling og reproduksjon, må dyr endre sin oppførsel for å takle dem 3,4,5. Imidlertid er nevrale kretser og mekanismer som ligger til grunn for slik atferdsendring dårlig forstått.
Mekanosensorisk oppførsel i nematoden, Caenorhabditis elegans, er et enkelt atferdsparadigme, der ormer vanligvis endrer oppførsel fra fremoverbevegelse til en bakoverfluktrespons når de støter på ikke-lokalisert vibrasjon6. Den nevrale kretsen som ligger til grunn for denne oppførselen består hovedsakelig av fem sensoriske nevroner, fire par internuroner og flere typer motoriske nevroner 7,8. I tillegg vaner ormer seg til slike mekaniske stimuli etter spredt trening som involverer gjentatt stimulering 9,10,11. Derfor utgjør denne enkle atferdsresponsen et ideelt system for å undersøke nevrale mekanismer som ligger til grunn for både ikke-lokalisert vibrasjons-fremkalt oppførsel og minne. En protokoll for kalsiumavbildning i fritt oppførende ormer under påvirkning av ikke-lokaliserte vibrasjoner er illustrert. Sammenlignet med tidligere rapporterte systemer, er dette systemet enkelt ved at det ikke krever et ekstra kamera for sporing; Det lar oss imidlertid endre frekvensen, forskyvningen og varigheten av ikke-lokalisert vibrasjon. Fordi aktivering av AVA-internuronene induserer fluktresponsen bakover, ble ormer som samtidig uttrykker GCaMP, en kalsiumindikator og TagRFP, et kalsium ufølsomt fluorescerende protein, under kontroll av en AVA-spesifikk promotor, brukt som et eksempel (se Tabell over materialer for detaljer). Protokollen demonstrerer aktivering av AVA-nevroner når en orm bytter fra fremover til bakover bevegelse. Denne protokollen letter forståelsen av den nevrale kretsmekanismen som ligger til grunn for mekanosensorisk oppførsel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Generelt krever kvantifisering av nevral aktivitet innføring av en sonde og / eller begrensninger på dyrekroppsbevegelse. Men for studier av mekanosensorisk oppførsel utgjør den invasive innføringen av en sonde og begrensninger seg selv mekaniske stimuli. C. elegans gir et system for å omgå disse problemene, fordi funksjonene er gjennomsiktige og fordi den har en enkel, kompakt nevral krets som bare består av 302 nevroner. Kombinere disse fordelene med den tidligere utviklede metoden for å fremkalle ikk…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Caenorhabditis Genetics Center for å gi stammene som brukes i denne studien. Denne publikasjonen ble støttet av JSPS KAKENHI Grant-in-Aid for Scientific research (B) (Grant No. JP18H02483), på Innovative områder “Science of Soft Robot” prosjekt (Grant No. JP18H05474), PRIME fra Japan Agency for Medical Research and Development (tilskuddsnummer 19gm6110022h001) og Shimadzu-stiftelsen.
Materials
| Data anaylsis software | |||
| DualViewImaging.nb | author | For analysis of acquired data | |
| Mathematica12 | Wolfram | For running data anaysis software DualViewImaging | |
| Escherichia coli and C. elegans strains | |||
| E. coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | Food for C. elegans. Uracil auxotroph. E. coli B. |
| lite-1(ce314) strain | Caenorhabditis Genetics Center | KG1180 | Light-insensitive mutant |
| lite-1(ce314) strain expressing NLS-GCaMP-NLS and TagRFP under the control of the AVA-speciric promoter | author | ST12 | lite-1(ce314) mutant carrying the genes expressing NLS-GCaMP5G-NLS (NLS; nuclear localization signal) and TagRFP under the control of the flp-18 promoter as an extrachoromosomal arrays |
| Laser Doppler vibrometer | |||
| Lase Doppler vibrometer | Polytec Japan | IVS-500 | For quantifying frequency and displacement generated by the accoustic transducer |
| Mouse macro system | |||
| Assay.txt | Author | Script for temporally and specially controlling mouse cursol in Windows | |
| HiMacroEx | Vector | https://www.vector.co.jp/download/file/winnt/util/fh667310.html | Free download software for controling mouse cursor based on a script |
| Nematode growth media plate | |||
| Agar purified, powder | Nakarai tesque | 01162-15 | For preparation of NGM plates |
| Bacto pepton | Becton Dickinson | 211677 | For preparation of NGM plates |
| Calcium chloride | Wako | 036-00485 | For preparation of NGM plates |
| Cholesterol | Wako | 034-03002 | For preparation of NGM plates |
| di-Photassium hydrogenphosphate | Nakarai tesque | 28727-95 | For preparation of NGM plates |
| LB broth, Lennox | Nakarai tesque | 20066-95 | For culture of E. coli OP50 |
| Magnesium sulfate anhydrous | TGI | M1890 | For preparation of NGM plates |
| Potassium Dihydrogenphosphate | Nakarai tesque | 28720-65 | For preparation of NGM plates |
| Sodium Chloride | Nakarai tesque | 31320-05 | For preparation of NGM plates |
| Petri dishes (60 mm) | Nunc | 150270 | For preparation of NGM plates |
| Nonlocalized vibration device | |||
| Amplifier | LEPY | LP-A7USB | For stimulation with controllable vibration |
| Acoustic transducer | MinebeaMitsumi | LVC25 | For stimulation with controllable vibration |
| WaveGene Ver. 1.5 | Thrive | http://efu.jp.net/soft/wg/down_wg.html | Free download software for controling vibration property |
| Noninvasive calcium imaging | |||
| 2-Channel benchtop 3-phase brushless DC servo controller | Thorlabs | BBD202 | Compatible controller for MLS203-1 stages |
| 479/585 nm BrightLine dual-band bandpass filter | Semrock | FF01-479/585-25 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| 505/606 nm BrightLine dual-edge standard epi-fluorescence dichroic beamsplitter | Semrock | FF505/606-Di01-25×36 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| 512/25 nm BrightLine single-band bandpass filter | Semrock | FF01-512/25-25 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| 630/92 nm BrightLine single-band bandpass filter | Semrock | FF01-630/92-25 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| Computer | Dell | Precision T7600 | Windows7 with Intel Xeon CPU ES-2630 and 8 GB of RAM |
| High-speed x-y motorized stage | Thorlabs | MLS203-1 | Fast XY scannning stage |
| Image splitting optics | Hamamatsu photonics | A12801-01 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) generated by W-VIEW GEMINI Image spliting optics |
| LED light source | CoolLED | pE-4000 | For generating 470 nm and 560 nm excitation light |
| Microscope | Olympus | MVX10 | |
| sCMOS camera | Andor | Zyla | |
| x 2 Objective lens | Olympus | MVPLAPO2XC | Working distance 20 mm and numerical aperture 0.5 |
| Plasmid | |||
| pKDK66 plasmid | author | pKDK66 | Co-injection marker |
| pTAK83 plasmid | author | pTAK83 | Plasmid for expression of TagRFP under the control of the flp-18 promoter |
| pTAK144 plasmid | author | pTAK144 | Plasmid for expression of NLS-GCaMP5G-NLS under the control of the flp-18 promoter |
| Tracking software | |||
| homingback.vi | author | SubVi file for tracking a fluoresent spot of a worm through feedback control of sCMOS camera and x-y motorized stage | |
| LabVIEW | National instruments | For running tracking software | |
| Zyla Control ver.2.6CI.vi | author | For tracking a fluoresent spot of a worm through feedback control of sCMOS camera and x-y motorized stage |
References
- Hill, P. S. M., Wessel, A. Biotremology. Current Biology. 26 (5), 187-191 (2016).
- Fettiplace, R., Hackney, C. M. The sensory and motor roles of auditory hair cells. Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 19-29 (2006).
- Vogel, V., Sheetz, M. Local force and geometry sensing regulate cell functions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (4), 265-275 (2006).
- Katta, S., Krieg, M., Goodman, M. B. Feeling force: physical and physiological principles enabling sensory mechanotransduction. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31, 347-371 (2015).
- Orr, A. W., Helmke, B. P., Blackman, B. R., Schwartz, M. A. Mechanisms of mechanotransduction. Developmental Cell. 10 (1), 11-20 (2006).
- Goodman, M. B., Sengupta, P. How Caenorhabditis elegans senses mechanical stress, temperature, and other physical stimuli. 유전학. 212 (1), 25-51 (2019).
- Chalfie, M., et al. The neural circuit for touch sensitivity in Caenorhabditis elegans. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 5 (4), 956-964 (1985).
- Wicks, S. R., Rankin, C. H. The integration of antagonistic reflexes revealed by laser ablation of identified neurons determines habituation kinetics of the Caenorhabditis elegans tap withdrawal response. Journal of Comparative Physiology. A Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 179 (5), 675-685 (1996).
- Rankin, C. H., Beck, C. D., Chiba, C. M. Caenorhabditis elegans: a new model system for the study of learning and memory. Behavioural Brain Research. 37 (1), 89-92 (1990).
- Bozorgmehr, T., Ardiel, E. L., McEwan, A. H., Rankin, C. H. Mechanisms of plasticity in a Caenorhabditis elegans mechanosensory circuit. Frontiers in Physiology. 4, 88 (2013).
- Sugi, T., Ohtani, Y., Kumiya, Y., Igarashi, R., Shirakawa, M. High-throughput optical quantification of mechanosensory habituation reveals neurons encoding memory in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (48), 17236-17241 (2014).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Sugi, T., Okumura, E., Kiso, K., Igarashi, R. Nanoscale mechanical stimulation method for quantifying C. elegans mechanosensory behavior and memory. Analytical Sciences: The International Journal of the Japan Society for Analytical Chemistry. 32 (11), 1159-1164 (2016).
- Brownell, P. H. Compressional and surface waves in sand: used by desert scorpions to locate prey. Science. 197 (4302), 479-482 (1977).
- Clark, D. A., Gabel, C. V., Gabel, H., Samuel, A. D. T. Temporal activity patterns in thermosensory neurons of freely moving Caenorhabditis elegans encode spatial thermal gradients. Journal of Neuroscience. 27 (23), 6083-6090 (2007).
- Tsukada, Y., et al. Reconstruction of spatial thermal gradient encoded in thermosensory neuron AFD in Caenorhabditis elegans. Journal of Neuroscience. 36 (9), 2571-2581 (2016).
- Piggott, B. J., Liu, J., Feng, Z., Wescott, S. A., Xu, X. Z. S. The neural circuits and synaptic mechanisms underlying motor initiation in C. elegans. Cell. 147 (4), 922-933 (2011).
- Nguyen, J. P., et al. Whole-brain calcium imaging with cellular resolution in freely behaving Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), 1074-1081 (2016).
- Schrodel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light. Nature Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).
- Prevedel, R., et al. Simultaneous whole-animal 3D imaging of neuronal activity using light-field microscopy. Nature Methods. 11, 727-730 (2014).
- Nichols, A. L. A., Eichler, T., Latham, R., Zimmer, M. A global brain state underlies C. elegans sleep behavior. Science. 356 (6344), (2017).
- Zheng, M., Cao, P., Yang, J., Xu, X. Z. S., Feng, Z. Calcium imaging of multiple neurons in freely behaving C. elegans. Journal of Neuroscience Methods. 206 (1), 78-82 (2012).
- Sugi, T., Ito, H., Nishimura, M., Nagai, K. H. C. elegans collectively forms dynamical networks. Nature Communications. 10 (1), 1-9 (2019).
