Imagem de cálcio em caenorhabditis livremente comportada elegans com vibração bem controlada e não localizada
Summary
Relatado aqui é um sistema de imagem de cálcio em se comportar livremente Caenorhabditis elegans com vibração bem controlada e não localizada. Este sistema permite que os pesquisadores evoquem vibrações não localizadas com propriedades bem controladas no deslocamento em nanoescala e quantifiquem as correntes de cálcio durante as respostas de C. elegans às vibrações.
Abstract
Forças mecânicas não localizadas, como vibrações e ondas acústicas, influenciam uma grande variedade de processos biológicos, desde o desenvolvimento até a homeostase. Os animais lidam com esses estímulos modificando seu comportamento. Compreender os mecanismos subjacentes a tal modificação comportamental requer quantificação da atividade neural durante o comportamento de interesse. Aqui, relatamos um método de imagem de cálcio em se comportar livremente caenorhabditis elegans com vibração não localizada de frequência, deslocamento e duração específicas. Este método permite a produção de vibração bem controlada e não localizada usando um transdutor acústico e quantificação de respostas de cálcio evocadas na resolução unicelular. Como prova de princípio, demonstra-se a resposta de cálcio de um único interneuron, AVA, durante a resposta de fuga de C. elegans à vibração. Este sistema facilitará a compreensão dos mecanismos neurais subjacentes às respostas comportamentais a estímulos mecânicos.
Introduction
Os animais são frequentemente expostos a estímulos mecânicos não localizados, como vibrações ou ondas acústicas 1,2. Como esses estímulos influenciam a homeostase, o desenvolvimento e a reprodução, os animais devem modificar seus comportamentos para lidar com eles 3,4,5. No entanto, os circuitos neurais e os mecanismos subjacentes a essa modificação comportamental são mal compreendidos.
O comportamento mecanosensorial no nematoide, Caenorhabditis elegans, é um simples paradigma comportamental, no qual os vermes geralmente mudam o comportamento do movimento para a frente para uma resposta de fuga para trás quando encontram vibração não localizada6. O circuito neural subjacente a esse comportamento é composto principalmente por cinco neurônios sensoriais, quatro pares de interneurônios e vários tipos de neurônios motores 7,8. Além disso, os vermes habituam-se a tais estímulos mecânicos após o treinamento espaçado envolvendo estimulação repetida 9,10,11. Portanto, essa simples resposta comportamental constitui um sistema ideal para investigar mecanismos neurais subjacentes tanto ao comportamento e à memória não localizados de vibração. Um protocolo para imagens de cálcio em vermes que se comportam livremente sob a influência de vibrações não localizadas é ilustrado. Comparado com sistemas relatados anteriormente, este sistema é simples na forma de não exigir uma câmera adicional para rastreamento; no entanto, permite-nos alterar a frequência, deslocamento e duração da vibração não localizada. Como a ativação dos interneurônios AVA induz a resposta de fuga para trás, os vermes co-expressando GCaMP, um indicador de cálcio, e TagRFP, uma proteína fluorescente insensível ao cálcio, sob o controle de um promotor específico da AVA foram usados como exemplo (ver Tabela de Materiais para detalhes). O protocolo demonstra a ativação dos neurônios AVA à medida que um verme muda de movimento para frente para trás. Este protocolo facilita a compreensão do mecanismo do circuito neural subjacente ao comportamento mecanosensorial.
Protocol
Representative Results
Discussion
Geralmente, a quantificação da atividade neural requer a introdução de uma sonda e/ou restrições ao movimento do corpo animal. No entanto, para estudos de comportamento mecanosensorial, a introdução invasiva de uma sonda e as próprias restrições constituem estímulos mecânicos. C. elegans fornece um sistema para contornar esses problemas, pois suas características são transparentes e porque tem um circuito neural simples e compacto que compreende apenas 302 neurônios. Combinando essas vantagens co…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao Centro de Genética de Caenorhabditis por fornecer as cepas utilizadas neste estudo. Esta publicação foi apoiada pela JSPS KAKENHI Grant-in-Aid for Scientific research (B) (Grant no. JP18H02483), sobre áreas inovadoras do projeto “Ciência do Robô Macio” (Grant no. JP18H05474), prime da Agência Japonesa de Pesquisa e Desenvolvimento Médico (número de subvenção 19gm611002h001), e a fundação Shimadzu.
Materials
| Data anaylsis software | |||
| DualViewImaging.nb | author | For analysis of acquired data | |
| Mathematica12 | Wolfram | For running data anaysis software DualViewImaging | |
| Escherichia coli and C. elegans strains | |||
| E. coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | Food for C. elegans. Uracil auxotroph. E. coli B. |
| lite-1(ce314) strain | Caenorhabditis Genetics Center | KG1180 | Light-insensitive mutant |
| lite-1(ce314) strain expressing NLS-GCaMP-NLS and TagRFP under the control of the AVA-speciric promoter | author | ST12 | lite-1(ce314) mutant carrying the genes expressing NLS-GCaMP5G-NLS (NLS; nuclear localization signal) and TagRFP under the control of the flp-18 promoter as an extrachoromosomal arrays |
| Laser Doppler vibrometer | |||
| Lase Doppler vibrometer | Polytec Japan | IVS-500 | For quantifying frequency and displacement generated by the accoustic transducer |
| Mouse macro system | |||
| Assay.txt | Author | Script for temporally and specially controlling mouse cursol in Windows | |
| HiMacroEx | Vector | https://www.vector.co.jp/download/file/winnt/util/fh667310.html | Free download software for controling mouse cursor based on a script |
| Nematode growth media plate | |||
| Agar purified, powder | Nakarai tesque | 01162-15 | For preparation of NGM plates |
| Bacto pepton | Becton Dickinson | 211677 | For preparation of NGM plates |
| Calcium chloride | Wako | 036-00485 | For preparation of NGM plates |
| Cholesterol | Wako | 034-03002 | For preparation of NGM plates |
| di-Photassium hydrogenphosphate | Nakarai tesque | 28727-95 | For preparation of NGM plates |
| LB broth, Lennox | Nakarai tesque | 20066-95 | For culture of E. coli OP50 |
| Magnesium sulfate anhydrous | TGI | M1890 | For preparation of NGM plates |
| Potassium Dihydrogenphosphate | Nakarai tesque | 28720-65 | For preparation of NGM plates |
| Sodium Chloride | Nakarai tesque | 31320-05 | For preparation of NGM plates |
| Petri dishes (60 mm) | Nunc | 150270 | For preparation of NGM plates |
| Nonlocalized vibration device | |||
| Amplifier | LEPY | LP-A7USB | For stimulation with controllable vibration |
| Acoustic transducer | MinebeaMitsumi | LVC25 | For stimulation with controllable vibration |
| WaveGene Ver. 1.5 | Thrive | http://efu.jp.net/soft/wg/down_wg.html | Free download software for controling vibration property |
| Noninvasive calcium imaging | |||
| 2-Channel benchtop 3-phase brushless DC servo controller | Thorlabs | BBD202 | Compatible controller for MLS203-1 stages |
| 479/585 nm BrightLine dual-band bandpass filter | Semrock | FF01-479/585-25 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| 505/606 nm BrightLine dual-edge standard epi-fluorescence dichroic beamsplitter | Semrock | FF505/606-Di01-25×36 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| 512/25 nm BrightLine single-band bandpass filter | Semrock | FF01-512/25-25 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| 630/92 nm BrightLine single-band bandpass filter | Semrock | FF01-630/92-25 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| Computer | Dell | Precision T7600 | Windows7 with Intel Xeon CPU ES-2630 and 8 GB of RAM |
| High-speed x-y motorized stage | Thorlabs | MLS203-1 | Fast XY scannning stage |
| Image splitting optics | Hamamatsu photonics | A12801-01 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) generated by W-VIEW GEMINI Image spliting optics |
| LED light source | CoolLED | pE-4000 | For generating 470 nm and 560 nm excitation light |
| Microscope | Olympus | MVX10 | |
| sCMOS camera | Andor | Zyla | |
| x 2 Objective lens | Olympus | MVPLAPO2XC | Working distance 20 mm and numerical aperture 0.5 |
| Plasmid | |||
| pKDK66 plasmid | author | pKDK66 | Co-injection marker |
| pTAK83 plasmid | author | pTAK83 | Plasmid for expression of TagRFP under the control of the flp-18 promoter |
| pTAK144 plasmid | author | pTAK144 | Plasmid for expression of NLS-GCaMP5G-NLS under the control of the flp-18 promoter |
| Tracking software | |||
| homingback.vi | author | SubVi file for tracking a fluoresent spot of a worm through feedback control of sCMOS camera and x-y motorized stage | |
| LabVIEW | National instruments | For running tracking software | |
| Zyla Control ver.2.6CI.vi | author | For tracking a fluoresent spot of a worm through feedback control of sCMOS camera and x-y motorized stage |
References
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