Imágenes de calcio en Caenorhabditis elegans de comportamiento libre con vibración no localizada y bien controlada
Summary
Aquí se informa un sistema para imágenes de calcio en Caenorhabditis elegans que se comportan libremente con vibración bien controlada y no localizada. Este sistema permite a los investigadores evocar vibraciones no localizadas con propiedades bien controladas a un desplazamiento a nanoescala y cuantificar las corrientes de calcio durante las respuestas de C. elegans a las vibraciones.
Abstract
Las fuerzas mecánicas no localizadas, como las vibraciones y las ondas acústicas, influyen en una amplia variedad de procesos biológicos desde el desarrollo hasta la homeostasis. Los animales hacen frente a estos estímulos modificando su comportamiento. Comprender los mecanismos subyacentes a dicha modificación del comportamiento requiere la cuantificación de la actividad neuronal durante el comportamiento de interés. Aquí, informamos un método para la obtención de imágenes de calcio en Caenorhabditis elegans de comportamiento libre con vibración no localizada de frecuencia, desplazamiento y duración específicos. Este método permite la producción de vibraciones bien controladas y no localizadas utilizando un transductor acústico y la cuantificación de las respuestas de calcio evocadas a resolución de una sola célula. Como prueba de principio, se demuestra la respuesta de calcio de una sola interneurona, AVA, durante la respuesta de escape de C. elegans a la vibración. Este sistema facilitará la comprensión de los mecanismos neuronales subyacentes a las respuestas conductuales a los estímulos mecánicos.
Introduction
Los animales suelen estar expuestos a estímulos mecánicos no localizados como vibraciones u ondas acústicas 1,2. Debido a que estos estímulos influyen en la homeostasis, el desarrollo y la reproducción, los animales deben modificar sus comportamientos para hacerles frente 3,4,5. Sin embargo, los circuitos neuronales y los mecanismos que subyacen a dicha modificación del comportamiento son poco conocidos.
El comportamiento mecanosensorial en el nematodo, Caenorhabditis elegans, es un paradigma conductual simple, en el que los gusanos generalmente cambian el comportamiento de un movimiento hacia adelante a una respuesta de escape hacia atrás cuando se encuentran con vibración no localizada6. El circuito neuronal subyacente a este comportamiento se compone principalmente de cinco neuronas sensoriales, cuatro pares de interneuronas y varios tipos de neuronas motoras 7,8. Además, los gusanos se habitúan a tales estímulos mecánicos después de un entrenamiento espaciado que implica estimulación repetida 9,10,11. Por lo tanto, esta respuesta conductual simple constituye un sistema ideal para investigar los mecanismos neuronales subyacentes tanto al comportamiento evocado por vibración no localizada como a la memoria. Se ilustra un protocolo para imágenes de calcio en gusanos que se comportan libremente bajo la influencia de vibraciones no localizadas. En comparación con los sistemas informados anteriormente, este sistema es simple en el sentido de que no requiere una cámara adicional para el seguimiento; sin embargo, nos permite cambiar la frecuencia, el desplazamiento y la duración de la vibración no localizada. Debido a que la activación de las interneuronas AVA induce la respuesta de escape hacia atrás, se utilizaron como ejemplo los gusanos que coexpresan GCaMP, un indicador de calcio, y TagRFP, una proteína fluorescente insensible al calcio, bajo el control de un promotor específico de AVA (ver Tabla de Materiales para más detalles). El protocolo demuestra la activación de las neuronas AVA a medida que un gusano cambia de movimiento hacia adelante hacia atrás. Este protocolo facilita la comprensión del mecanismo del circuito neuronal subyacente al comportamiento mecanosensorial.
Protocol
Representative Results
Discussion
En general, la cuantificación de la actividad neuronal requiere la introducción de una sonda y / o restricciones en el movimiento del cuerpo animal. Sin embargo, para los estudios del comportamiento mecanosensorial, la introducción invasiva de una sonda y las restricciones en sí mismas constituyen estímulos mecánicos. C. elegans proporciona un sistema para eludir estos problemas, porque sus características son transparentes y porque tiene un circuito neuronal simple y compacto que comprende solo 302 neuro…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al Centro de Genética Caenorhabditis por proporcionar las cepas utilizadas en este estudio. Esta publicación fue apoyada por JSPS KAKENHI Grant-in-Aid for Scientific research (B) (Grant no. JP18H02483), sobre áreas innovadoras del proyecto “Science of Soft Robot” (Grant no. JP18H05474), el PRIME de la Agencia Japonesa de Investigación y Desarrollo Médico (número de subvención 19gm6110022h001), y la fundación Shimadzu.
Materials
| Data anaylsis software | |||
| DualViewImaging.nb | author | For analysis of acquired data | |
| Mathematica12 | Wolfram | For running data anaysis software DualViewImaging | |
| Escherichia coli and C. elegans strains | |||
| E. coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | Food for C. elegans. Uracil auxotroph. E. coli B. |
| lite-1(ce314) strain | Caenorhabditis Genetics Center | KG1180 | Light-insensitive mutant |
| lite-1(ce314) strain expressing NLS-GCaMP-NLS and TagRFP under the control of the AVA-speciric promoter | author | ST12 | lite-1(ce314) mutant carrying the genes expressing NLS-GCaMP5G-NLS (NLS; nuclear localization signal) and TagRFP under the control of the flp-18 promoter as an extrachoromosomal arrays |
| Laser Doppler vibrometer | |||
| Lase Doppler vibrometer | Polytec Japan | IVS-500 | For quantifying frequency and displacement generated by the accoustic transducer |
| Mouse macro system | |||
| Assay.txt | Author | Script for temporally and specially controlling mouse cursol in Windows | |
| HiMacroEx | Vector | https://www.vector.co.jp/download/file/winnt/util/fh667310.html | Free download software for controling mouse cursor based on a script |
| Nematode growth media plate | |||
| Agar purified, powder | Nakarai tesque | 01162-15 | For preparation of NGM plates |
| Bacto pepton | Becton Dickinson | 211677 | For preparation of NGM plates |
| Calcium chloride | Wako | 036-00485 | For preparation of NGM plates |
| Cholesterol | Wako | 034-03002 | For preparation of NGM plates |
| di-Photassium hydrogenphosphate | Nakarai tesque | 28727-95 | For preparation of NGM plates |
| LB broth, Lennox | Nakarai tesque | 20066-95 | For culture of E. coli OP50 |
| Magnesium sulfate anhydrous | TGI | M1890 | For preparation of NGM plates |
| Potassium Dihydrogenphosphate | Nakarai tesque | 28720-65 | For preparation of NGM plates |
| Sodium Chloride | Nakarai tesque | 31320-05 | For preparation of NGM plates |
| Petri dishes (60 mm) | Nunc | 150270 | For preparation of NGM plates |
| Nonlocalized vibration device | |||
| Amplifier | LEPY | LP-A7USB | For stimulation with controllable vibration |
| Acoustic transducer | MinebeaMitsumi | LVC25 | For stimulation with controllable vibration |
| WaveGene Ver. 1.5 | Thrive | http://efu.jp.net/soft/wg/down_wg.html | Free download software for controling vibration property |
| Noninvasive calcium imaging | |||
| 2-Channel benchtop 3-phase brushless DC servo controller | Thorlabs | BBD202 | Compatible controller for MLS203-1 stages |
| 479/585 nm BrightLine dual-band bandpass filter | Semrock | FF01-479/585-25 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| 505/606 nm BrightLine dual-edge standard epi-fluorescence dichroic beamsplitter | Semrock | FF505/606-Di01-25×36 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| 512/25 nm BrightLine single-band bandpass filter | Semrock | FF01-512/25-25 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| 630/92 nm BrightLine single-band bandpass filter | Semrock | FF01-630/92-25 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| Computer | Dell | Precision T7600 | Windows7 with Intel Xeon CPU ES-2630 and 8 GB of RAM |
| High-speed x-y motorized stage | Thorlabs | MLS203-1 | Fast XY scannning stage |
| Image splitting optics | Hamamatsu photonics | A12801-01 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) generated by W-VIEW GEMINI Image spliting optics |
| LED light source | CoolLED | pE-4000 | For generating 470 nm and 560 nm excitation light |
| Microscope | Olympus | MVX10 | |
| sCMOS camera | Andor | Zyla | |
| x 2 Objective lens | Olympus | MVPLAPO2XC | Working distance 20 mm and numerical aperture 0.5 |
| Plasmid | |||
| pKDK66 plasmid | author | pKDK66 | Co-injection marker |
| pTAK83 plasmid | author | pTAK83 | Plasmid for expression of TagRFP under the control of the flp-18 promoter |
| pTAK144 plasmid | author | pTAK144 | Plasmid for expression of NLS-GCaMP5G-NLS under the control of the flp-18 promoter |
| Tracking software | |||
| homingback.vi | author | SubVi file for tracking a fluoresent spot of a worm through feedback control of sCMOS camera and x-y motorized stage | |
| LabVIEW | National instruments | For running tracking software | |
| Zyla Control ver.2.6CI.vi | author | For tracking a fluoresent spot of a worm through feedback control of sCMOS camera and x-y motorized stage |
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