Kalciumavbildning i fritt uppträdande Caenorhabditis elegans med välkontrollerad, icke-lokaliserad vibration
Summary
Rapporterat här är ett system för kalciumavbildning i fritt uppträdande Caenorhabditis elegans med välkontrollerad, icke-lokal vibration. Detta system gör det möjligt för forskare att framkalla icke-lokaliserade vibrationer med välkontrollerade egenskaper vid förskjutning i nanoskala och att kvantifiera kalciumströmmar under C. elegans svar på vibrationerna.
Abstract
Icke-lokaliserade mekaniska krafter, såsom vibrationer och akustiska vågor, påverkar en mängd olika biologiska processer från utveckling till homeostas. Djur hanterar dessa stimuli genom att ändra sitt beteende. Att förstå mekanismerna bakom sådan beteendemodifiering kräver kvantifiering av neural aktivitet under beteendet av intresse. Här rapporterar vi en metod för kalciumavbildning i fritt uppträdande Caenorhabditis elegans med icke-lokal vibration av specifik frekvens, förskjutning och varaktighet. Denna metod möjliggör produktion av välkontrollerade, icke-lokaliserade vibrationer med användning av en akustisk givare och kvantifiering av framkallade kalciumsvar vid encellsupplösning. Som ett principbevis demonstreras kalciumsvaret hos en enda interneuron, AVA, under C. elegans flyktrespons på vibrationer. Detta system kommer att underlätta förståelsen av neurala mekanismer som ligger till grund för beteendemässiga svar på mekaniska stimuli.
Introduction
Djur utsätts ofta för icke-lokaliserade mekaniska stimuli som vibrationer eller akustiska vågor 1,2. Eftersom dessa stimuli påverkar homeostas, utveckling och reproduktion måste djur ändra sina beteenden för att klara dem 3,4,5. De neurala kretsarna och mekanismerna som ligger till grund för sådan beteendemodifiering är emellertid dåligt förstådda.
Mekanosensoriskt beteende i nematoden, Caenorhabditis elegans, är ett enkelt beteendeparadigm, där maskar vanligtvis ändrar beteende från framåtrörelse till ett bakåtgående flyktsvar när de stöter på icke-lokal vibration6. Den neurala kretsen som ligger till grund för detta beteende består huvudsakligen av fem sensoriska neuroner, fyra par interneuroner och flera typer av motorneuroner 7,8. Dessutom vanor vanor till sådana mekaniska stimuli efter distanserad träning som involverar upprepad stimulering 9,10,11. Därför utgör detta enkla beteendemässiga svar ett idealiskt system för att undersöka neurala mekanismer som ligger till grund för både icke-lokaliserat vibrationsframmanerat beteende och minne. Ett protokoll för kalciumavbildning i fritt uppträdande maskar under påverkan av icke-lokaliserade vibrationer illustreras. Jämfört med tidigare rapporterade system är detta system enkelt eftersom det inte kräver en extra kamera för spårning; Det tillåter oss dock att ändra frekvensen, förskjutningen och varaktigheten av icke-lokal vibration. Eftersom aktivering av AVA-interneuronerna inducerar det bakåtriktade flyktsvaret användes maskar som samuttrycker GCaMP, en kalciumindikator och TagRFP, ett kalciumokänsligt fluorescerande protein, under kontroll av en AVA-specifik promotor som ett exempel (se Materialtabell för detaljer). Protokollet visar aktiveringen av AVA-neuroner när en mask växlar från framåt till bakåtrörelse. Detta protokoll underlättar förståelsen av den neurala kretsmekanismen som ligger till grund för mekanosensoriskt beteende.
Protocol
Representative Results
Discussion
I allmänhet kräver kvantifieringen av neural aktivitet införande av en sond och / eller begränsningar av djurkroppsrörelser. För studier av mekanosensoriskt beteende utgör emellertid den invasiva introduktionen av en sond och begränsningar själva mekaniska stimuli. C. elegans tillhandahåller ett system för att kringgå dessa problem, eftersom dess egenskaper är transparenta och eftersom den har en enkel, kompakt neural krets som endast omfattar 302 neuroner. Genom att kombinera dessa fördelar med de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Caenorhabditis Genetics Center för att tillhandahålla de stammar som används i denna studie. Denna publikation stöddes av JSPS KAKENHI Grant-in-Aid for Scientific Research (B) (Grant nr. JP18H02483), om projektet Innovativa områden “Science of Soft Robot” (Bidrag nr. JP18H05474), PRIME från Japan Agency for Medical Research and Development (bidragsnummer 19gm6110022h001) och Shimadzu-stiftelsen.
Materials
| Data anaylsis software | |||
| DualViewImaging.nb | author | For analysis of acquired data | |
| Mathematica12 | Wolfram | For running data anaysis software DualViewImaging | |
| Escherichia coli and C. elegans strains | |||
| E. coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | Food for C. elegans. Uracil auxotroph. E. coli B. |
| lite-1(ce314) strain | Caenorhabditis Genetics Center | KG1180 | Light-insensitive mutant |
| lite-1(ce314) strain expressing NLS-GCaMP-NLS and TagRFP under the control of the AVA-speciric promoter | author | ST12 | lite-1(ce314) mutant carrying the genes expressing NLS-GCaMP5G-NLS (NLS; nuclear localization signal) and TagRFP under the control of the flp-18 promoter as an extrachoromosomal arrays |
| Laser Doppler vibrometer | |||
| Lase Doppler vibrometer | Polytec Japan | IVS-500 | For quantifying frequency and displacement generated by the accoustic transducer |
| Mouse macro system | |||
| Assay.txt | Author | Script for temporally and specially controlling mouse cursol in Windows | |
| HiMacroEx | Vector | https://www.vector.co.jp/download/file/winnt/util/fh667310.html | Free download software for controling mouse cursor based on a script |
| Nematode growth media plate | |||
| Agar purified, powder | Nakarai tesque | 01162-15 | For preparation of NGM plates |
| Bacto pepton | Becton Dickinson | 211677 | For preparation of NGM plates |
| Calcium chloride | Wako | 036-00485 | For preparation of NGM plates |
| Cholesterol | Wako | 034-03002 | For preparation of NGM plates |
| di-Photassium hydrogenphosphate | Nakarai tesque | 28727-95 | For preparation of NGM plates |
| LB broth, Lennox | Nakarai tesque | 20066-95 | For culture of E. coli OP50 |
| Magnesium sulfate anhydrous | TGI | M1890 | For preparation of NGM plates |
| Potassium Dihydrogenphosphate | Nakarai tesque | 28720-65 | For preparation of NGM plates |
| Sodium Chloride | Nakarai tesque | 31320-05 | For preparation of NGM plates |
| Petri dishes (60 mm) | Nunc | 150270 | For preparation of NGM plates |
| Nonlocalized vibration device | |||
| Amplifier | LEPY | LP-A7USB | For stimulation with controllable vibration |
| Acoustic transducer | MinebeaMitsumi | LVC25 | For stimulation with controllable vibration |
| WaveGene Ver. 1.5 | Thrive | http://efu.jp.net/soft/wg/down_wg.html | Free download software for controling vibration property |
| Noninvasive calcium imaging | |||
| 2-Channel benchtop 3-phase brushless DC servo controller | Thorlabs | BBD202 | Compatible controller for MLS203-1 stages |
| 479/585 nm BrightLine dual-band bandpass filter | Semrock | FF01-479/585-25 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| 505/606 nm BrightLine dual-edge standard epi-fluorescence dichroic beamsplitter | Semrock | FF505/606-Di01-25×36 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| 512/25 nm BrightLine single-band bandpass filter | Semrock | FF01-512/25-25 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| 630/92 nm BrightLine single-band bandpass filter | Semrock | FF01-630/92-25 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) |
| Computer | Dell | Precision T7600 | Windows7 with Intel Xeon CPU ES-2630 and 8 GB of RAM |
| High-speed x-y motorized stage | Thorlabs | MLS203-1 | Fast XY scannning stage |
| Image splitting optics | Hamamatsu photonics | A12801-01 | For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) generated by W-VIEW GEMINI Image spliting optics |
| LED light source | CoolLED | pE-4000 | For generating 470 nm and 560 nm excitation light |
| Microscope | Olympus | MVX10 | |
| sCMOS camera | Andor | Zyla | |
| x 2 Objective lens | Olympus | MVPLAPO2XC | Working distance 20 mm and numerical aperture 0.5 |
| Plasmid | |||
| pKDK66 plasmid | author | pKDK66 | Co-injection marker |
| pTAK83 plasmid | author | pTAK83 | Plasmid for expression of TagRFP under the control of the flp-18 promoter |
| pTAK144 plasmid | author | pTAK144 | Plasmid for expression of NLS-GCaMP5G-NLS under the control of the flp-18 promoter |
| Tracking software | |||
| homingback.vi | author | SubVi file for tracking a fluoresent spot of a worm through feedback control of sCMOS camera and x-y motorized stage | |
| LabVIEW | National instruments | For running tracking software | |
| Zyla Control ver.2.6CI.vi | author | For tracking a fluoresent spot of a worm through feedback control of sCMOS camera and x-y motorized stage |
References
- Hill, P. S. M., Wessel, A. Biotremology. Current Biology. 26 (5), 187-191 (2016).
- Fettiplace, R., Hackney, C. M. The sensory and motor roles of auditory hair cells. Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 19-29 (2006).
- Vogel, V., Sheetz, M. Local force and geometry sensing regulate cell functions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (4), 265-275 (2006).
- Katta, S., Krieg, M., Goodman, M. B. Feeling force: physical and physiological principles enabling sensory mechanotransduction. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31, 347-371 (2015).
- Orr, A. W., Helmke, B. P., Blackman, B. R., Schwartz, M. A. Mechanisms of mechanotransduction. Developmental Cell. 10 (1), 11-20 (2006).
- Goodman, M. B., Sengupta, P. How Caenorhabditis elegans senses mechanical stress, temperature, and other physical stimuli. 유전학. 212 (1), 25-51 (2019).
- Chalfie, M., et al. The neural circuit for touch sensitivity in Caenorhabditis elegans. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 5 (4), 956-964 (1985).
- Wicks, S. R., Rankin, C. H. The integration of antagonistic reflexes revealed by laser ablation of identified neurons determines habituation kinetics of the Caenorhabditis elegans tap withdrawal response. Journal of Comparative Physiology. A Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 179 (5), 675-685 (1996).
- Rankin, C. H., Beck, C. D., Chiba, C. M. Caenorhabditis elegans: a new model system for the study of learning and memory. Behavioural Brain Research. 37 (1), 89-92 (1990).
- Bozorgmehr, T., Ardiel, E. L., McEwan, A. H., Rankin, C. H. Mechanisms of plasticity in a Caenorhabditis elegans mechanosensory circuit. Frontiers in Physiology. 4, 88 (2013).
- Sugi, T., Ohtani, Y., Kumiya, Y., Igarashi, R., Shirakawa, M. High-throughput optical quantification of mechanosensory habituation reveals neurons encoding memory in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (48), 17236-17241 (2014).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Sugi, T., Okumura, E., Kiso, K., Igarashi, R. Nanoscale mechanical stimulation method for quantifying C. elegans mechanosensory behavior and memory. Analytical Sciences: The International Journal of the Japan Society for Analytical Chemistry. 32 (11), 1159-1164 (2016).
- Brownell, P. H. Compressional and surface waves in sand: used by desert scorpions to locate prey. Science. 197 (4302), 479-482 (1977).
- Clark, D. A., Gabel, C. V., Gabel, H., Samuel, A. D. T. Temporal activity patterns in thermosensory neurons of freely moving Caenorhabditis elegans encode spatial thermal gradients. Journal of Neuroscience. 27 (23), 6083-6090 (2007).
- Tsukada, Y., et al. Reconstruction of spatial thermal gradient encoded in thermosensory neuron AFD in Caenorhabditis elegans. Journal of Neuroscience. 36 (9), 2571-2581 (2016).
- Piggott, B. J., Liu, J., Feng, Z., Wescott, S. A., Xu, X. Z. S. The neural circuits and synaptic mechanisms underlying motor initiation in C. elegans. Cell. 147 (4), 922-933 (2011).
- Nguyen, J. P., et al. Whole-brain calcium imaging with cellular resolution in freely behaving Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), 1074-1081 (2016).
- Schrodel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light. Nature Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).
- Prevedel, R., et al. Simultaneous whole-animal 3D imaging of neuronal activity using light-field microscopy. Nature Methods. 11, 727-730 (2014).
- Nichols, A. L. A., Eichler, T., Latham, R., Zimmer, M. A global brain state underlies C. elegans sleep behavior. Science. 356 (6344), (2017).
- Zheng, M., Cao, P., Yang, J., Xu, X. Z. S., Feng, Z. Calcium imaging of multiple neurons in freely behaving C. elegans. Journal of Neuroscience Methods. 206 (1), 78-82 (2012).
- Sugi, T., Ito, H., Nishimura, M., Nagai, K. H. C. elegans collectively forms dynamical networks. Nature Communications. 10 (1), 1-9 (2019).
