JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
신경과학

Вывод, Расширение, Криоконсервация и Характеристика микрососудистых эндотелиальных клеток мозга из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток

Published: November 19, 2020
doi:
10.3791/61629
, ,
1Center for Genomic Medicine,Massachusetts General Hospital, 2Department of Psychiatry,Beth Israel Deaconess Medical Center, 3Chemical Biology and Therapeutic Science Program,Broad Institute of MIT and Harvard, 4Department of Psychiatry,Harvard Medical School, 5Schizophrenia and Bipolar Disorder Program,McLean Hospital

Summary

Этот протокол подробно адаптированный метод для получения, расширения и криопресервного мозга микрососудистых эндотелиальных клеток, полученных путем дифференциации человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, а также для изучения свойств гемового барьера мозга в модели ex vivo.

Abstract

Микрососудистые эндотелиальные клетки мозга (BMECs) могут быть дифференцированы от индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs) для разработки ex vivo клеточных моделей для изучения функции гемового мозга барьера (BBB). Этот измененный протокол содержит подробные шаги по получению, расширению и криопресервированию БМЕК от человеческих iPSCs с использованием различных доноров и реагентов, чем те, которые сообщалось в предыдущих протоколах. iPSCs обрабатываются с существенным 6 средних в течение 4 дней, а затем 2 дней человека эндотелиальной сыворотки свободной культуры среды дополняется основным фактором роста фибробластов, ретинойной кислоты и B27 дополнения. В день 6, клетки суб-культурных на коллагена / фибронектина матрицы в течение 2 дней. Иммуноцитохимия проводится в день 8 для анализа маркеров BMEC с использованием CLDN5, OCLN, TJP1, PECAM1 и SLC2A1. Западный blotting выполняется для подтверждения выражения маркера BMEC, и отсутствие SOX17, эндодермальный маркер. Ангиогенный потенциал демонстрируется с прорастания анализа. Транс-эндотелиальное электрическое сопротивление (TEER) измеряется с помощью электродов палочки и вольтомметра, начиная с 7-го дня. Деятельность транспортера Efflux для АТФ, связывающего кассетный субсемейный член B 1 и АТФ, связывающего кассетный субсемейный член C 1, измеряется с помощью многоэтажного считыватель на 8-й день. Успешное выведение BMECs подтверждается наличием соответствующих клеточных маркеров, низким уровнем SOX17, ангиогенным потенциалом, транспортерной активностью и значениями TEER 2000 Ω x cm2. BMECs расширены до дня 10 перед passaging на свежеокрашенных коллагена / фибронектина пластин или криоконсервированных. Этот протокол демонстрирует, что BMECs, полученные iPSC, могут быть расширены и пролететь по крайней мере один раз. Однако снижение значений TEER и более низкая локализация маркеров BMEC наблюдались после криоконсервации. БМЕК могут быть использованы в экспериментах совместной культуры с другими типами клеток (нейроны, глиа, перициты), в трехмерных моделях мозга (орган-чип и гидрогель), для васкуляризации органоидов мозга, а также для изучения дисфункции BBB при нейропсихиатрических расстройствах.

Introduction

Функция гемово-мозгового барьера
Гемово-мозговой барьер (BBB) образует границу, которая ограничивает движение веществ из крови в мозг. BBB состоит из микрососудистых эндотелиальных клеток мозга (BMECs), которые образуют монослой, выстилающий сосуды. БМЕК вместе со астроцитами, нейронами, перицитами, микроглией и внеклеточной матрицей образуют нервно-сосудистый блок. BMECs имеют жестко регулируемую параклеточную структуру, которая позволяет BBB поддерживать высокое транс-эндотелиальное электрическое сопротивление (TEER), которое ограничивает пассивную диффузию и служит индикатором барьернойцелостности 1,2. BMECs также имеют белки, которые помогают с трансклеточного движения, такие как эндоцитоз, трансцитоз, и трансмиграции, а также экстравазии лейкоцитов во время иммунногоответа 3. BMECs полагаться на приток и эффлюкс транспортеров для питания и удаления отходов, для того, чтобы поддерживать гомеостатический баланс в головном мозге3. Например, solute перевозчика семьи 2 члена 1 (SLC2A1) является приток транспортер отвечает за движение глюкозы через BBB4, в то время как efflux транспортеры, такие как ATP связывания кассеты субсемейный член B 1 (ABCB1) и ATP связывания кассеты субсемейный член C 1 (ABCC1) несут ответственность за возвращение субстратов обратно в кровоток3,5,7. ABCB1 субстраты включают морфин, verapamil4, и антипсихотики, такие как оланзапин ирисперидон 8, в то время как транспортер ABCC1 имеет различные субстраты, включая сульфатные конъюгаты, винкристин, и глюкуронидконъюгирует 4.

Применение моделей BBB при психических расстройствах
BBB дисфункция была вовлечена в ряд неврологических и психических расстройств, в том числе шизофрении и биполярногорасстройства 9,10. В последнее время, iPSC полученных ex vivo клеточных моделей в настоящее время используются для допроса клеточных и молекулярных основ психических расстройств, но эти модели в настоящее время не принимают во внимание потенциальную роль, которую играет нейроваскулатура11,12,13. Предполагается, что периферические воспалительные цитокины, циркулирующие вкрови,могут негативно повлиять на BBB14,15,16,17,но есть также доказательства для параклеточных18,19,20,21,22, трансцеллюлярные23,24,25,26,27,28,29,и внеклеточнойматрицы 20,29,30,31,32 аномалии способствует дисфункции BBB. Нарушение BBB может привести к содержанию крови, поступающих в мозг паренхима и активации астроцитов и / или микроглии, чтобы освободить провоспалительные цитокины, которые, в свою очередь, инициироватьвоспалительные реакции 33, которые могут иметь пагубные последствиядля мозга 34. BMECs являются основным компонентом BBB и изучения структуры и функции этих клеток может повысить понимание дисфункции BBB в неврологических и психических расстройств.

Альтернативные модели BMEC
До разработки эффективных протоколов для получения BMECs от iPSCs1,6,35,36, исследователи использовали увековеченные BMECs37 для изучения функции BBB. Тем не менее, многие из этих моделей не смогли достичь желаемого BBB фенотипов, такой физиологический диапазон значений TEER38,39. Использование iPSCs имеет то преимущество, сохраняя генетический фон человека, из которого клетки получены. Ученые активно работают над созданием iPSC-производных ex vivo микросреду модели, которые резюмируют структуру и функцию человеческого мозга. Исследователи разработали методы для получения BMECs, которые структурно и физиологически похожи на BMECs найти in vivo. Методы получения очищенных популяций БМЕК, полученных из iPSC, требуют ряда различных шагов, при этом в последние нескольколет оптимизированы протоколы 1,6,35,36. Как правило, БМЕК, полученные iPSC, культурированы в среде Essential 6 (E6) в течение 4 дней, а затем в течение 2 дней в эндотелиальной сыворотке человека свободной среды (hESFM) дополняется основным фактором роста фибробластов (bFGF), ретинойной кислоты (RA), и B27 дополнения. Клетки затем культури на коллагена IV (COL4) и фибронектина (FN) матрицы для получения 90% однородных BMECs1.

Идентичность БМЕК подтверждается иммунофлуоресценцией, показывающей совместное выражение белков BMEC, включая тромбоцитно-эндотелиарную молекулу адгезии клеток-1 (PECAM1), SLC2A1, и жесткие белки соединения, такие как плотный белок соединения 1 (TJP1), occludin (OCLN) и claudin-5 (CLDN5)6. Прорастание анализы были использованы для подтверждения ангиогенного потенциала IPSC полученных БМЕК. 6 Целостность BMECs BBB оценивается наличием физиологических значений IN vitro TEER (2000 х см2) 37иизмеримой активностью для транспортеров эффлюкса, таких как ABCB1 и ABCC11,6,36. Недавние методологические достижения группы Lippmann привели к iPSC-производным протоколам BMEC с уменьшенной экспериментальной изменчивостью и повышенной воспроизводимостью1. Однако неизвестно, могут ли они быть расширены и выйти за пределы субподготовной стадии. Наш измененный протокол направлен на решение этой проблемы путем прохода BMECs, полученных iPSC, за 8-й день и оценки того, могут ли они быть дополнительно расширены, чтобы сохранить свойства BBB после криоконсервации. Хотя никакие исследования не описали прохождение IPSC полученных BMECs, протокол существует для криоконсервации BMEC, который сохраняет физиологические свойства BBB после прохождения замораживания оттепелицикла 40. Тем не менее, не известно, после криоконсервации BMECs могут быть провечены и сохранить свойства BBB.

BMECs, полученные из iPSCs с помощью протокола Lippmann были использованы для моделирования BBB нарушения неврологических расстройств, таких как болезнь Хантингтона7. Такие БМЕК, полученные iPSC, также использовались для исследования влияния бактериальной инфекции, такой как Neisseria meningitidis или Group B Streptococcus на нарушение гембо-CSF барьера и BBB соответственно41,42. Кроме того, используя IPSC полученных BMECs от 22q удаления синдрома пациентов с шизофренией, исследователи наблюдали увеличение межклеточной молекулы адгезии-1 (ICAM-1), основные молекулы адгезии в BMECs, которые помогают с набором и экстравазиилейкоцитов в мозг 43. Взятые вместе, эти исследования демонстрируют полезность IPSC полученных БМЕК для изучения BBB нарушения в сложных нейропсихиатрических расстройств.

Protocol

Человеческие iPSCs были перепрограммированы из фибробластов здоровых доноров, используяпротокол,утвержденный Институциональный обзор советов Массачусетской больницы общего профиля и больницы Маклин, и характеризуется как описано впредыдущих исследованиях 44,<sup class=…

Representative Results

Дифференциация BMECСледует точно следовать нескольким важным шагам в этом протоколе(рисунок 1). E6 среднего использования на день 1 имеет важное значение, так как он часто используется для получения нейроэктодерм линии от iPSCs в течение относительно короткого пе?…

Discussion

Модификации и устранение неполадок

В этом протоколе мы внесли некоторые изменения в использование широко используемой внеклеточной матрицы и средств культуры клеток во время культивирования iPSC для производных БМЕК(рисунок 1). Эти изменения не ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Национальным институтом психического здоровья Биобехавиоальные исследования Награды для инновационных новых ученых (BRAINS) Премия R01MH113858 (К.К.), Национальные институты здравоохранения премии KL2 TR002542 (PL). Национальный институт психического здоровья клинического научного развития премии K08MH086846 (в Р.К.), Сидней R Baer Jr Фонд Грант (P.L.) Дорис Дьюк Благотворительный фонд клинического научного развития премии (R.K.), Райан Лихт Сан Биполярный фонд (в Р.К.), Филлис и Джером Лайл Раппапорт Фонд (К.К.), Гарвардский институт стволовых клеток (R.K.) и Стив Уиллис и Элисса Фрейд (R.K.). Мы благодарим доктора Энни Катурию за ее критическое чтение и отзывы о рукописи.

Materials

2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate Sigma Aldrich D6883-50MG
Accutase Sigma Aldrich A6964-100mL
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgG Life Technologies A-21202
Alexa Fluor 555 Donkey anti-Rabbit IgG Life Technologies A-31572
B27 Supplement Thermo Fisher Scientific 17504044
CD31 (PECAM-1) (89C2) Mouse mAb Cell Signaling 3528S
CLDN5 (Claudin-5) Thermo Fisher Scientific 35-2500
Collagen IV from human placenta Sigma Aldrich C5533-5mg
Corning 2 mL Internal Threaded Polypropylene Cryogenic Vial  Corning  8670
Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates (6-wells) Corning 353046
Corning Falcon Flat Bottom Cell Culture Plates (24-wells) Corning 353047
Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts (12-wells) Corning 3460
Countess slides Thermo Fisher Scientific C10228
DMEM/F12 (without phenol red) Thermo Fisher Scientific  A1413202
DMSO Sigma Aldrich D2438-50mL
Donkey serum Sigma Aldrich D9663-10ML
DPBS (+/+) Gibco/Thermo Fisher Scientific 14040-117
Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter (EVOM2) STX2 World Precision Instruments N/A
Essential 6 Medium (Thermo Fisher) Thermo Fisher Scientific A1516401
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma Aldrich F2442
Fibronectin Sigma Aldrich F2006-2mg
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix Thermo Fisher Scientific A1413202
Hanks' Balance Salt Solution with calcium and magnesium  Thermo Fisher Scientific 24020-117
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate Thermo Fisher Scientific H3570
Human endothelial serum-free medium Thermo Fisher Scientific 11111044
InCell Analyzer 6000 General Electric N/A
Invitrogen Countess Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific N/A
MK-571 Sigma Aldrich M7571-5MG
NutriStem Stemgent 01-0005
Occludin Thermo Fisher Scientific 33-1500
Paraformaldehyde 16% Electron Microscopy Services 15710
Perkin Elmer Envision 2103 multi-plate Reader Perkin Elmer N/A
Recombinant Human VEGF 165 Peprotech 100-20
Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) Peprotech 100-18B
Retinoic acid Sigma Aldrich R2625-100MG
Rhodamine 123 Sigma Aldrich 83702-10MG
SLC2A1 (GLUT-1) ThermoFisher PA1-21041
SOX17 Cell Signaling 81778S
TJP-1 (ZO-1) ThermoFisher PA5-28869
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787-50ML
Trypan Blue Stain (0.4%) for use with the Countess Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific T10282
Valspodar (Sigma) (cyclosporin A) Sigma Aldrich SML0572-5MG
Versene solution Thermo Fisher Scientific 15040066
Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor) Tocris/Thermo Fisher Scientific 1254
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Neal, E. H., et al. A Simplified, Fully Defined Differentiation Scheme for Producing Blood-Brain Barrier Endothelial Cells from Human iPSCs. Stem Cell Reportsorts. 12, 1380-1388 (2019).
  2. Smith, Q. R., Rapoport, S. I. Cerebrovascular Permeability Coefficients to Sodium, Potassium, and Chloride. Journal of Neurochemistry. 46, 1732-1742 (2006).
  3. Liebner, S., et al. Functional morphology of the blood-brain barrier in health and disease. Acta Neuropathologica. 135, 311-336 (2018).
  4. Sanchez-Covarrubias, L., Slosky, L., Thompson, B., Davis, T., Ronaldson, P. Transporters at CNS Barrier Sites: Obstacles or Opportunities for Drug Delivery. Current Pharmaceutical Design. 20, 1422-1449 (2014).
  5. Stamatovic, S., Keep, R., Andjelkovic, A. Brain Endothelial Cell-Cell Junctions: How to “Open” the Blood Brain Barrier. Current Neuropharmacology. 6, 179-192 (2008).
  6. Lippmann, E. S., et al. Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 30, 783-791 (2012).
  7. Lim, R. G., et al. Huntington’s Disease iPSC-Derived Brain Microvascular Endothelial Cells Reveal WNT-Mediated Angiogenic and Blood-Brain Barrier Deficits. Cell Reports. 19, 1365-1377 (2017).
  8. Eum, S., Lee, A. M., Bishop, J. R. Pharmacogenetic tests for antipsychotic medications: clinical implications and considerations. Dialogues in Clinical Neuroscience. 18, 323-337 (2016).
  9. Najjar, S., et al. Neurovascular Unit Dysfunction and Blood–Brain Barrier Hyperpermeability Contribute to Schizophrenia Neurobiology: A Theoretical Integration of Clinical and Experimental Evidence. Frontiers in Psychiatry. 8, 83 (2017).
  10. Pollak, T. A., et al. The blood-brain barrier in psychosis. Lancet Psychiatry. 5, 79-92 (2018).
  11. Watmuff, B., et al. Disease signatures for schizophrenia and bipolar disorder using patient-derived induced pluripotent stem cells. Molecular and Cellular Neuroscience. 73, 96-103 (2016).
  12. Watmuff, B., Liu, B., Karmacharya, R. Stem cell-derived neurons in the development of targeted treatment for schizophrenia and bipolar disorder. Pharmacogenomics. 18, 471-479 (2017).
  13. Karmacharya, R., Haggarty, S. J. Stem cell models of neuropsychiatric disorders. Molecular and Cellular Neuroscience. 73, 1-2 (2016).
  14. Hwang, Y., et al. Gene expression profiling by mRNA sequencing reveals increased expression of immune/inflammation-related genes in the hippocampus of individuals with schizophrenia. Translational Psychiatry. 3, 321 (2013).
  15. Kim, S. Transcriptome sequencing of the choroid plexus in schizophrenia. Translational Psychiatry. 11, (2016).
  16. Lizano, P., et al. Association of Choroid Plexus Enlargement With Cognitive, Inflammatory, and Structural Phenotypes Across the Psychosis Spectrum. American Journal of Psychiatry. 176, 564-572 (2019).
  17. Harris, L. W., et al. The Cerebral Microvasculature in Schizophrenia: A Laser Capture Microdissection Study. PLoS ONE. 3, 3964 (2008).
  18. Greene, C., Hanley, N., Campbell, M. Claudin-5: gatekeeper of neurological function. Fluids and Barriers of the CNS. 16, 3 (2019).
  19. Maes, M., Sirivichayakul, S., Kanchanatawan, B., Vodjani, A. Breakdown of the Paracellular Tight and Adherens Junctions in the Gut and Blood Brain Barrier and Damage to the Vascular Barrier in Patients with Deficit Schizophrenia. Neurotoxicity Research. 36, 306-322 (2019).
  20. Katsel, P., Roussos, P., Pletnikov, M., Haroutunian, V. Microvascular anomaly conditions in psychiatric disease. Schizophrenia – connection. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 77, 327-339 (2017).
  21. Pouget, J. G., et al. Genome-Wide Association Studies Suggest Limited Immune Gene Enrichment in Schizophrenia Compared to 5 Autoimmune Diseases. Schizophrenia Bulletin. 42, 1176-1184 (2016).
  22. Luo, X., et al. Systematic Prioritization and Integrative Analysis of Copy Number Variations in Schizophrenia Reveal Key Schizophrenia Susceptibility Genes. Schizophrenia Bulletin. , 15 (2014).
  23. Cai, H. Q., et al. Increased macrophages and changed brain endothelial cell gene expression in the frontal cortex of people with schizophrenia displaying inflammation. Molecular Psychiatry. , (2018).
  24. Katsel, P., Davis, K. L., Gorman, J. M., Haroutunian, V. Variations in differential gene expression patterns across multiple brain regions in schizophrenia. Schizophrenia Research. 77, 241-252 (2005).
  25. de Klerk, O. L., et al. Regional increase in P-glycoprotein function in the blood-brain barrier of patients with chronic schizophrenia. Psychiatry Research: Neuroimaging. 183, 151-156 (2010).
  26. Hoosain, F. G., et al. Bypassing P-Glycoprotein Drug Efflux Mechanisms: Possible Applications in Pharmacoresistant Schizophrenia Therapy. BioMed Research International. 2015, 1-21 (2015).
  27. Kimchi-Sarfaty, C., et al. A “Silent” Polymorphism in the MDR1 Gene Changes Substrate Specificity. Science. 315, 525-528 (2007).
  28. Martínez-Magaña, J. J., et al. Exploratory Analysis of Rare and Novel Variants in Mexican Patients Diagnosed with Schizophrenia and Dementia. Revista de Investigación Clínica. 71, 1879 (2019).
  29. Girard, S. L., et al. Increased exonic de novo mutation rate in individuals with schizophrenia. Nature Genetics. 43, 860-863 (2011).
  30. Xu, B., et al. De novo gene mutations highlight patterns of genetic and neural complexity in schizophrenia. Nature Genetics. 44, 1365-1369 (2012).
  31. Kurian, S. M. Identification of blood biomarkers for psychosis using convergent functional genomics. Molecular Psychiatry. 22, (2011).
  32. Prata, D. P., Costa-Neves, B., Cosme, G., Vassos, E. Unravelling the genetic basis of schizophrenia and bipolar disorder with GWAS: A systematic review. Journal of Psychiatric Research. 114, 178-207 (2019).
  33. Trépanier, M. O., Hopperton, K. E., Mizrahi, R., Mechawar, N., Bazinet, R. P. Postmortem evidence of cerebral inflammation in schizophrenia: a systematic review. Molecular Psychiatry. 21, 1009-1026 (2016).
  34. Busse, S., et al. Different distribution patterns of lymphocytes and microglia in the hippocampus of patients with residual versus paranoid schizophrenia: Further evidence for disease course-related immune alterations. Brain, Behavior, and Immunity. 26, 1273-1279 (2012).
  35. Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Scientific Reports. 4, 4160 (2015).
  36. Hollmann, E. K., et al. Accelerated differentiation of human induced pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Fluids and Barriers of the CNS. 14, 9 (2017).
  37. Srinivasan, B., Kolli, A. R., Barichello, T. Transepithelial/Transendothelial Electrical Resistance (TEER) to Measure the Integrity of Blood-Brain Barrier. Blood-Brain Barrier. 142, 99-114 (2019).
  38. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. 19, 1872-1874 (2005).
  39. Eigenmann, D. E., et al. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids and Barriers of the CNS. 10, 33 (2013).
  40. Wilson, H. K., Faubion, M. G., Hjortness, M. K., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Cryopreservation of Brain Endothelial Cells Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells Is Enhanced by Rho-Associated Coiled Coil-Containing Kinase Inhibition. Tissue Engineering Part C: Methods. 22, 1085-1094 (2016).
  41. Martins Gomes, S. F., et al. Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Brain Endothelial Cells as a Cellular Model to Study Neisseria meningitidis Infection. Frontiers in Microbiology. 10, 1181 (2019).
  42. Kim, B. J., et al. Modeling Group B Streptococcus and Blood-Brain Barrier Interaction by Using Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Brain Endothelial Cells. mSphere. 2, 00398 (2017).
  43. Crockett, A. M., et al. Disruption of the Blood-Brain Barrier in 22q11.2 Deletion Syndrome. biorXiv. , (2019).
  44. Kathuria, A., et al. Synaptic deficits in iPSC-derived cortical interneurons in schizophrenia are mediated by NLGN2 and rescued by N-acetylcysteine. Translational Psychiatry. 9, 321 (2019).
  45. Kathuria, A., et al. Transcriptomic Landscape and Functional Characterization of Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cerebral Organoids in Schizophrenia. JAMA Psychiatry. , (2020).
  46. Kathuria, A., et al. Transcriptome analysis and functional characterization of cerebral organoids in bipolar disorder. Genome Medicine. 12, 34 (2020).
  47. Warren, L., Lin, C. mRNA-Based Genetic Reprogramming. Molecular Therapy. 27, 729-734 (2019).
  48. Eaton, S. L., et al. A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies. Journal of Visualized Experiments. , 52099 (2014).
  49. Wang, P., Rodriguez, R. T., Wang, J., Ghodasara, A., Kim, S. K. Targeting SOX17 in Human Embryonic Stem Cells Creates Unique Strategies for Isolating and Analyzing Developing Endoderm. Cell Stem Cell. 8, 335-346 (2011).
  50. Blume, L. F., Denker, M., Kunze, T., et al. Temperature corrected transepithelial electrical resistance (TEER) measurement to quantify rapid changes in paracellular permeability. Pharmazie. , 19-24 (2010).
  51. Chen, K. G., Mallon, B. S., McKay, R. D. G., Robey, P. G. Human Pluripotent Stem Cell Culture: Considerations for Maintenance, Expansion, and Therapeutics. Cell Stem Cell. 14, 13-26 (2014).
  52. Pham, M. T., et al. Generation of human vascularized brain organoids. NeuroReport. 29, 588-593 (2018).
  53. Mansour, A. A., et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nature Biotechnology. 36, 432-441 (2018).
  54. Baruah, J., Vasudevan, A. The Vessels Shaping Mental Health or Illness. Open Neuroimaging Journal. 13, 1-9 (2019).
  55. Lopes, R., Soares, R., Coelho, R., Figueiredo-Braga, M. Angiogenesis in the pathophysiology of schizophrenia – comprehensive review and a conceptual hypothesis. Life Sciences. 128, 79-93 (2015).
  56. Wilson, H. K., Canfield, S. G., Hjortness, M. K., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Exploring the effects of cell seeding density on the differentiation of human pluripotent stem cells to brain microvascular endothelial cells. Fluids and Barriers of the CNS. 12, 13 (2015).

Tags

Keywords: Brain Microvascular Endothelial CellsHuman Induced Pluripotent Stem CellsBlood-brain BarrierBMEC DerivationBMEC ExpansionBMEC CryopreservationBMEC CharacterizationTEER AnalysisEfflux Transporter ActivityDisease Modeling
check_url/kr/61629?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Pong, S., Lizano, P., Karmacharya, R. Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (165), e61629, doi:10.3791/61629 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image