이 프로토콜은 낭포성 섬유증 환자의 객담 내에서 박테리아 세포 및 다당류 합성 위치(Psl) 다당류의 시각화 방법을 제공합니다.
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이 논문에서
요약
초록
낭포성 섬유증 환자의 폐 내에서 녹농균을 조기에 발견하고 근절하면 만성 감염 발병 가능성을 줄일 수 있습니다. 만성 녹농균 감염의 발병은 폐 기능 저하 및 이환율 증가와 관련이 있습니다. 따라서 소아 환자의 약 10-40%에서 발생하는 항생제 요법으로 녹농균을 근절하지 못하는 이유를 밝히는 데 큰 관심이 있습니다. 녹농균(P. aeruginosa)의 숙주 청소율과 항생제 감수성에 영향을 미칠 수 있는 많은 요인 중 하나는 공간 조직(예: 응집 또는 생물막 형성) 및 다당류 생산의 변화입니다. 따라서 CF 환자의 객담 내에서 녹농균의 현장 특성을 시각화하는 데 관심이 있었습니다. 숙주 세포에 대한 3D 구조를 유지하기 위해 샘플을 하이드로겔 매트릭스에 삽입한 후 객담 샘플에 조직 투명화 기술을 적용했습니다. 조직 투명화 후 형광 라벨과 염료를 추가하여 시각화를 가능하게 했습니다. 박테리아 세포의 시각화를 위해 형광 in situ 교잡화를 수행하고, 외다당류의 시각화를 위해 형광 표지된 항-PSL 항체의 결합을 수행하고, 구조적 통찰력을 얻기 위해 숙주 세포를 염색하기 위한 DAPI 염색을 수행했습니다. 이러한 방법을 통해 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 통해 CF 환자의 객담 내 녹농균의 고해상도 이미징을 수행할 수 있었습니다.
서론
이 연구에서 실험은 소아 낭포성 섬유증(CF) 환자의 객담 내에서 녹농균의 생체 내 구조를 시각화하도록 설계되었습니다. 녹농균 감염은 소아 CF 인구의 30-40%에서 만성화됩니다. 만성 감염이 발생하면 제거가 거의 불가능합니다1. 녹농균은 일반적으로 항균제에 더 취약하기 때문에 만성 감염을 예방하기 위해 항슈도몬 항생제로 치료한다2. 안타깝게도, 모든 녹농균 분리가 항생제 치료 후 폐에서 효과적으로 제거되는 것은 아닙니다. 항생제 실패와 관련된 정확한 메커니즘은 완전히 밝혀지지 않았습니다. 이전 연구에서는 생물막 세포 밀도, 응집 및 다당류 생산의 변화가 항생제 효능에 영향을 미칠 수 있음을 보여주었습니다3. 녹농균(P. aeruginosa)은 펠(Pel), 피슬(Psl), 알긴산(alginate)의 세 가지 세포외 다당류를 생산합니다4. 녹농균(P. aeruginosa)의 대부분의 균주는 각 외다당류를 발현할 수 있는 유전적 능력을 가지고 있지만, 종종 한 종류의 다당류가 주로 발현된다5
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프로토콜
연구 윤리 위원회(REB)의 승인은 인간 피험자로부터 객담 샘플을 수집하고 보관하는 데 필요합니다. 본 연구에 제시된 연구는 Hospital for Sick Children REB#1000058579의 승인을 받았습니다.
1. 객담 채취
- 객담을 멸균 채취 컵에 보관하고 즉시 4°C에서 최대 24시간 동안 보관한 후 고정합니다.
알림: 가래를 고정하지 않고 4°C에서 너무 오래 방치하면 세포 분해, 특히 백혈구 분해가 발생할 수 있습니다. 가능한 한 빨리 고정하는 것이 좋습니다. - 객담 검체를 멸균된 15mL 튜브로 옮깁니다.
- 객담 샘플에 동일한 부피의 4% 파라포름알데히드(PFA)를 추가합니다. 예를 들어, 객담 샘플이 0.5mL인 경우 0.5mL의 4% PFA를 추가합니다. 부드러운 반전으로 섞는다.
- 4 °C에서 밤새 가래를 배양합니다.
- 고정 객담 2mL 각각에 5mL의 인산염 완충 식염수(PBS)를 추가하여 샘플을 세척합니다.
알림: 이 세척 단계에는 원심분리가 필요하지 않습니다. - 피펫으로 상층액을 조심스럽게 제거합니다.
알림: 팁을 가래에서 멀어지게 하여 피펫으로 가래를 빨아들이지 말고 표면 액체에서 매우 천천히 흡인....
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결과
실험의 전체 설계는 그림 1 과 그림 2에 요약되어 있습니다. 그림 1 은 객담 처리 및 객담 제거 프로토콜에 대한 요약을 제공합니다. 객담 처리 및 청소에는 최대 17일이 소요될 수 있습니다. 그러나 프로토콜은 중단될 수 있으며 샘플은 PFA 고정 후(2일) 또는 조직 투명화 후(투명 시간에 따라 5-17일) 보관할 수 있습니다. 그림 2에는 FISH와 항체 결합 프로토콜이 요약되어 있습니다. FISH 및 항체 염색 프로토콜은 완료하는 데 4일이 소요되지만 완료되면 완료하고 컨포칼 이미지를 촬영해야 합니다. 위의 프로토콜을 사용하면 녹농균 세포의 고해상도 3D 이미지를 객담 내 in-situ 구조로 시각화하여 얻을 수 있습니다.
이 프로토콜에 사용된 .......
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토론
이 프로토콜의 목적은 CF 환자의 객담에서 녹농균 세포의 현장 조직을 엿볼 수 있도록 하는 것입니다. 객담 샘플은 즉시 고정할 수 없는 경우 처리할 때까지 4°C에서 보관해야 합니다. 객담 내 녹농균(P. aeruginosa) 세포 수는 4°C에서 보관할 때 1시간, 24시간 또는 48시간에 처리하면 크게 변하지 않지만, 25°C에서 24시간 또는 48시간 동안 방치하면 박테리아 성장의 결과로 박테리아 세포 수가 크게 증가한다는 것이 입증되었다14. 이 연구를 위해 객담 샘플은 객담 후 최대 24시간까지 4°C에서 보관되었습니다. 염증 세포 수는 4 °C에 두었다가 9시간 이상 후에 처리하면 객담이 감소하는 것으로 나타났다는 점에 유의해야 한다15. 따라서 시료 처리를 위한 마감 시간을 결정할 때 객담에서 시각화하려는 특정 세포와 마커를 고려하는 것이 중요합니다.
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감사의 글
저자들은 이 연구에 자금을 지원한 낭포성 섬유증 재단(Cystic Fibrosis Foundation)과 항-Psl0096 항체를 아낌없이 기증한 MedImmune에 감사의 뜻을 전합니다. 이 연구를 위해 이미징은 토론토 대학의 CAMiLoD 이미징 시설에서 수행되었습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 29 : 1 아크릴 아미드 bisacrylamide, 30 % 용액 | BioRad | 161-0146 | |
| 8 챔버 커버 글라스 Nunc Lab-Tek | ThermoFischer Scientific | 155411 | |
| Anaerogen2.5L | Oxid Inc. | 35108 | |
| 커버웰 관류 챔버 | 전자 현미경 과학 | 70326 -12/-14 | |
| HistoDenz | Sigma | D2158 | |
| Protect RNA Rnase 억제제 | Sigma | R7387 | |
| PseaerA - GGTAACCGTCCCCCTTGC | Eurofins | 주문 세부 정보: 제품: Modified DNA Oligo; 이름: PseaerA; 순서: [Alexa488]GGTAACCGTCCCCCTTGC; 합성: 50 nmol; 정화 : HPLC; 선박 상태: 완전 수율(건조) | |
| Psl0096-텍사스 레드 | 메드면역 | Psl0096-텍사스 레드 항체는 메드이뮨에서 친절하게 제공한 선물로 주문 문의는 회사에 연락해야 합니다. | |
| VA-044 경화제 | 와코 | 27776-21-21 |
참고문헌
- Banerjee, D., Stableforth, D. The treatment of respiratory pseudomonas infection in cystic fibrosis: What drug and which way. Drugs. 60 (5), 1053-1064 (2000).
- Rosenfeld, M., Ramsey, B. W., Gibson, R. L.
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재인쇄 및 허가
