Génération sans OGM de cellules neuronales dérivées du sang
Summary
Nous présentons une méthode (GM-free) génétiquement modifiée pour obtenir des cellules avec un phénotype neuronal des cellules sanguines périphériques reprogrammées. L’activation d’une voie de signalisation liée à une nouvelle protéine humaine liée au GPI révèle une méthode efficace sans OGM pour obtenir des cellules souches pluripotentes humaines.
Abstract
De nombreux troubles neurologiques humains sont causés par la dégénérescence des neurones et des cellules gliales dans le cerveau. En raison des limites des stratégies pharmacologiques et autres stratégies thérapeutiques, il n’y a actuellement aucun remède disponible pour le cerveau blessé ou malade. Le remplacement cellulaire apparaît comme une stratégie thérapeutique prometteuse pour des conditions neurodegenerative. À ce jour, des cellules souches neurales (CSCN) ont été générées avec succès à partir de tissus fœtaux, de cellules embryonnaires humaines (SE) ou de cellules souches pluripotentes induites (CSPi). Un processus de dédifférenciatation a été initié par l’activation de la glycoprotéine GPI-liée humaine nouvelle, qui mène à la génération des cellules souches pluripotentes. Ces cellules souches pluripotentes dérivées du sang (BD-PSCs) différencient in vitro en cellules avec un phénotype neural comme montré par brightfield et microscopie d’immunofluorescence. L’analyse d’ultrastructure de ces cellules au moyen de la microscopie électronique confirme leur structure primitive aussi bien que neuronal-comme la morphologie et les caractéristiques subcellulaires.
Introduction
Le développement de méthodes de recherche fondamentale et préclinique sur les cellules souches encourage l’application clinique de thérapies à base de cellules souches pour les maladies neurologiques. Une telle thérapie potentielle dépend de manière critique de la méthode de génération de cellules neurales humaines conduisant à la récupération fonctionnelle1.
Les cellules souches neurales (CNS) s’auto-renouvellent et se différencient en nouveaux neurones tout au long de la vie dans un processus appelé neurogenèse adulte. Seules les zones cérébrales très restreintes abritent des NSC compétents pour générer des neurones nouveau-nés à l’âge adulte. Ces NSCs peuvent donner naissance à des neurones matures, qui sont impliqués dans l’apprentissage et la mémoire, remplaçant ainsi les neurones perdus ou endommagés. Malheureusement, ces NSC sont présents en quantités restreintes et cette neurogenèse limitée diminue rapidement au cours du développement juvénile2. Par conséquent, d’autres sources de cellules neurales doivent être considérées dans un objectif de thérapie cellulaire.
Les maladies neurologiques dégénératives sont difficiles à guérir en utilisant des approches pharmacologiques standard. De nouvelles stratégies thérapeutiques pour embrasser de nombreux troubles neurologiques immédicables sont basées sur des thérapies de remplacement cellulaire de tissus malades et blessés. La transplantation de NSC pourrait remplacer les cellules endommagées et fournir des bienfaits. D’autres sources de remplacement des cellules neurales comprennent les cellules souches embryonnaires humaines (ESC), qui sont dérivées de la masse cellulaire interne des blastocystes mammifères3, ainsi que les cspi4, qui ont une grande capacité d’auto-renouvellement comme les CSE et sont capables de se différencier en diverses lignées cellulaires. Les NSC peuvent également être générés par reprogrammation directe à partir de fibroblastes humains évitant l’état pluripotent5.
La thérapie de remplacement cellulaire est toujours un problème difficile. Bien que l’ESC, le fœtus ou l’iPS puissent être une source de génération de cellules neuronales pour traiter de nombreuses maladies neurologiques incurables, le remplacement autologue des cellules de SC adultes des tissus endommagés est une meilleure alternative qui contourne les préoccupations immunologiques, éthiques et de sécurité.
L’activation de la protéine humaine liée au GPI par réticulation d’anticorps via la phosphorylation de PLCγ/PI3K/Akt/mTor/PTEN déclenche une dédifférenciatation des cellules progénitrices sanguines et la génération de cellules souches pluripotentes dérivées du sang (BD-PSCs)6. Ces cellules différencient in vitro vers les cellules neuronales comme confirmé au moyen de brightfield, d’immunofluorescence et d’analyse par microscopie électronique à transmission (TEM).
Dans ce travail nous décrivons la génération GM-libre de BD-PSCs et leur re-différenciation réussie en cellules avec le phénotype neuronal.
Protocol
Representative Results
Discussion
La méthode non-GM de reprogrammation des cellules humaines décrite dans ce travail est basée sur l’activation de membrane à noyau de la ou des machines de signalisation derrière la glycoprotéine de membrane humaine liée au GPI qui initie le processus de dédifférenciatation menant à la génération ex vivo et à l’expansion de PSCs autorenouvants obtenus à partir de sang périphérique humain non manipulé. Ces cellules, lorsqu’elles sont cultivées dans des milieux appropriés, sont capables de …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dédié à la mémoire du Dr Rainer Saffrich.
Les auteurs sont particulièrement reconnaissants à José Manuel García-Verdugo et Vicente Herranz-Pérez d’avoir effectué des expériences et des analyses em au Laboratoire de neurobiologie comparative, Institut de biodiversité et de biologie évolutive de Cavanilles, Université de Valence, CIBERNED, Valence, Espagne, qui a été soutenu par un financement de recherche de la subvention Prometeo pour les groupes de recherche d’excellence PROMETEO/2019/075. Le reste de ces travaux a été soutenu par ACA CELL Biotech GmbH Heidelberg, Allemagne.
Materials
| Albumin Fraction V | Roth | T8444.4 | |
| Anti-GFAP Cy3 conjugate | Merck Millipore | MAB3402C3 | |
| Anti-MAP2 Alexa Fluor 555 | Merck Millipore | MAB3418A5 | |
| Anti-Nestin Alexa Fluor 488 | Merck Millipore | MAB5326A4 | |
| Anti-Tuj1 Alexa Fluor 488 | BD Pharmingen | 560381 | |
| AO/PI Cell Viability kit | Biozym | 872045 | Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems. |
| Ascorbic acid 2-phosphate sequimagnes | Sigma Aldrich | A8960-5G | |
| B27 Serum free 50x | Fisher Scientific (Gibco) | 11530536 | |
| Basic FGF solution | Fisher Scientific (Gibco) | 10647225 | |
| Biocoll | Merck Millipore | L6115-BC | density gradient media |
| BSA Frac V 7.5% | Gibco | 15260037 | |
| CD45 MicroBeads | Miltenyi | 130-045-801 | nano-sized magnetic beads |
| Cell counting slides Luna | Biozym | 872010 | Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems. |
| Chamber Slides Lab-Tek | Fisher Scientific | 10234121 | |
| D-MEM/F12 | Merck Millipore | FG4815-BC | |
| Durcupan | Sigma Aldrich | 44610 | epoxy resin |
| FBS | Merck Millipore | S0115/1030B | Discontinued. Available under: TMS-013-B |
| GDNF recombinant human | Fisher Scientific (Gibco) | 10679963 | |
| GlutaMax 100x | Gibco | 35050038 | L-glutamine |
| Glutaraldehyde grade | Sigma-Aldrich | G5882-50ML | |
| Heparin sodium cell | Sigma-Aldrich | H3149-50KU | |
| Human BDNF | Fisher Scientific (Gibco) | 11588836 | |
| Iscove (IMDM) | Biochrom | FG0465 | |
| Laminin mouse | Fisher Scientific (Gibco) | 10267092 | |
| Lead citrate | Sigma-Aldrich | 15326-25G | |
| Luna FL Automated Cell Counter | Biozym | 872040 | Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems. |
| MACS Buffer | Miltenyi | 130-091-221 | |
| MEM NEAA 100x | Gibco | 11140035 | |
| MiniMACS Trennsäulen | Miltenyi | 130-042-201 | |
| Morada digital camera | Olympus | ||
| Multiplatte Nunclon 4 wells | Fisher Scientific | 10507591 | |
| N2 Supplement 100x | Fisher Scientific (Gibco) | 11520536 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 10888022 | |
| PBS sterile | Roth | 9143.2 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957-50ML | |
| Super Glue-3 Loctite | Henkel | ||
| TEM FEI Technai G2 Spirit | FEI Europe | ||
| Ultracut UC-6 | Leica | ||
| Uranyl acetate C | EMS | 22400 |
References
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