Summary

דור ללא GM של תאים עצביים שמקורם בדם

Published: February 13, 2021
doi:

Summary

אנו מציגים שיטה ללא הנדסה גנטית (ללא GM) כדי להשיג תאים עם פנוטיפ עצבי מתאי דם היקפיים מתוכנתים מחדש. הפעלה של מסלול איתות המקושר לחלבון חדשני הקשור ל- GPI אנושי חושפת שיטה יעילה ללא GM להשגת תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים.

Abstract

הפרעות נוירולוגיות אנושיות רבות נגרמות על ידי ניוון של נוירונים ותאי גליה במוח. בשל מגבלות באסטרטגיות פרמקולוגיות וטיפוליות אחרות, אין כיום תרופה זמינה למוח הפגוע או החולה. החלפת תאים מופיעה כאסטרטגיה טיפולית מבטיחה לתנאים ניווניות. עד היום, תאי גזע עצביים (NSCs) נוצרו בהצלחה מרקמות עובריות, תאים עובריים אנושיים (ES) או תאי גזע פלוריפוטנטים המושרים (iPSC). תהליך של דיפרנציה יזם על ידי הפעלה של גליקופרוטאין אנושי חדשני הקשור ל- GPI, המוביל ליצירת תאי גזע פלוריפוטנטים. תאי גזע פלוריפוטנטים אלה שמקורם בדם (BD-PSCs) מבדילים במבחנה לתאים עם פנוטיפ עצבי כפי שמוצג על ידי מיקרוסקופיה brightfield ו- immunofluorescence. ניתוח אולטרה-מבני של תאים אלה באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים מאשר את המבנה הפרימיטיבי שלהם, כמו גם מורפולוגיה דמוית נוירונים ומאפיינים תת-תאיים.

Introduction

פיתוח שיטות מחקר בסיסיות ופרה-קליניות של תאי גזע מעודד יישום קליני של טיפולים מבוססי תאי גזע למחלות נוירולוגיות. טיפול פוטנציאלי כזה תלוי באופן קריטי בשיטה ליצירת תאים עצביים אנושיים המובילים להתאוששות תפקודית1.

תאי גזע עצביים (NSCs) מחדשים ומבדילים לנוירונים חדשים לאורך החיים בתהליך הנקרא נוירוגנזה בוגרת. רק אזורי מוח מוגבלים מאוד מכילים NSCs המוכשרים ליצור נוירונים שזה עתה נולדו בבגרות. NSCs כאלה יכולים להוליד נוירונים בוגרים, המעורבים בלמידה ובזיכרון, ובכך להחליף נוירונים אבודים או פגומים. למרבה הצער, NSCs אלה נמצאים בכמויות מוגבלות זה neurogenesis מוגבל פוחתת במהירות במהלך התפתחות לנוער2. לכן, מקורות אחרים של תאים עצביים חייבים להיחשב במטרה טיפול בתא.

מחלות נוירולוגיות ניווניות קשה לרפא באמצעות גישות פרמקולוגיות סטנדרטיות. אסטרטגיות טיפוליות חדשות לאימוץ הפרעות נוירולוגיות רבות שאינן ניתנות לחיסון מבוססות על טיפולים בתחליפי תאים של רקמה חולה ופצועה. השתלת המל”ל יכולה להחליף תאים פגומים ולספק השפעות מועילות. מקורות אחרים להחלפת תאים עצביים כוללים תאי גזע עובריים אנושיים (ESC), הנגזרים ממסת התא הפנימית של הבלסטוציסטות של היונקים3, כמו גם IPSCs4, אשר יש יכולת התחדשות עצמית נרחבת כמו ESCs ומסוגלים להבדיל לתוך שושלות תאים שונות. NSCs יכול גם להיווצר על ידי תכנות מחדש ישיר מפיברובלסטים אנושיים הימנעות מצב pluripotent5.

טיפול בתחליפי תאים הוא עדיין נושא מאתגר. למרות ש- ESC, עוברי או IPS יכולים להיות מקור ליצירת תאים עצביים לטיפול במחלות נוירולוגיות רבות חשוכות מרפא, החלפת תאי SCs למבוגרים אוטולוגיים של רקמות פגומות היא חלופה טובה יותר שעוקפת חששות אימונולוגיים, אתיים ובטיחותיים.

הפעלה של חלבון הקשור ל- GPI אנושי על ידי קישור נוגדנים באמצעות זרחן של PLCγ / PI3K / Akt / mTor / PTEN יוזמת דיפרנציאציה של תאי צאצא דם ויצירת תאי גזע פלוריפוטנטים שמקורם בדם (BD-PSCs)6. תאים אלה מבדילים במבחנה כלפי תאים עצביים כפי שאושרו באמצעות ניתוח מיקרוסקופיית אלקטרונים בהירה, אימונופלואורסצנטיות ומיקרוסקופיית אלקטרונים שידור (TEM).

בעבודה זו אנו מתארים את הדור ללא GM של מחשבי BD-PSCs ואת ההבחנה מחדש המוצלחת שלהם לתאים עם פנוטיפ עצבי.

Protocol

אישורים אתיים התקבלו בעת ביצוע הניסויים. 1. בידוד של תאים חד-גרעיניים בדם היקפי אנושי (PBMNCs) ודא שכל התורמים חתמו על הסכמה מדעת לפני נסיגת דם בהתאם להנחיות המוסדיות. קח 30 מ”ל של דם מתורמים בריאים על ידי צוות רפואי מיומן על פי הפרוטוקול הסטנדרטי. בודד מחשבי PBMNCs לפ…

Representative Results

התוצאות מספקות ראיות לכך ששיטה חדשנית זו ללא GM מסוגלת להחזיר תאי אבות דם למצבם הפרימיטיבי ביותר מבלי לפעול ישירות על הגנום האנושי. הוכחנו בעבר כי קישור נוגדנים ספציפי לחלבון הקשור ל- GPI יוזם באמצעות PLCγ/IP3K/Akt/mTOR/PTEN upregulation של גנים רלוונטיים התפתחותית שמורים מאוד כגון WNT, NOT…

Discussion

שיטת התמנות מחדש של תאים אנושיים המתוארים בעבודה זו מבוססת על הפעלה ממברנה לגרעין של מכונות איתותים מאחורי גליקופרוטאין הממברנה האנושית הקשורה ל- GPI היוזמת את תהליך הדיפרנציאציה המובילה ליצירת ex vivo והרחבת מחשבים מתחדשים עצמית המתקבלים מדם היקפי אנושי שאינו מניפולציה. תאים אלה כאשר ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

מוקדש לזכרו של ד”ר ריינר סאפריך.

המחברים אסירי תודה במיוחד לחוזה מנואל גרסיה-ורדוגו ווויסנטה הרנץ-פרז על ביצוע ניסויים וניתוח EM במעבדה לנוירוביולוגיה השוואתית, מכון קוואניל למגוון ביולוגי וביולוגיה אבולוציונית, אוניברסיטת ולנסיה, CIBERNED, ולנסיה, ספרד, שנתמכה על ידי מימון מחקר מענק פרומטאו לקבוצות מחקר מצוינות PROMETEO/2019/075. שאר העבודה נתמכה על ידי ACA CELL ביוטכנולוגיה GmbH היידלברג, גרמניה.
 

Materials

Albumin Fraction V Roth T8444.4
Anti-GFAP Cy3 conjugate Merck Millipore MAB3402C3
Anti-MAP2 Alexa Fluor 555 Merck Millipore MAB3418A5
Anti-Nestin Alexa Fluor 488 Merck Millipore MAB5326A4
Anti-Tuj1 Alexa Fluor 488 BD Pharmingen 560381
AO/PI Cell Viability kit Biozym 872045 Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.
Ascorbic acid 2-phosphate sequimagnes Sigma Aldrich A8960-5G
B27 Serum free 50x Fisher Scientific (Gibco) 11530536
Basic FGF solution Fisher Scientific (Gibco) 10647225
Biocoll Merck Millipore L6115-BC density gradient media
BSA Frac V 7.5% Gibco 15260037
CD45 MicroBeads Miltenyi 130-045-801 nano-sized magnetic beads
Cell counting slides Luna Biozym 872010 Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.
Chamber Slides Lab-Tek Fisher Scientific 10234121
D-MEM/F12 Merck Millipore FG4815-BC
Durcupan Sigma Aldrich 44610 epoxy resin
FBS Merck Millipore S0115/1030B Discontinued. Available under: TMS-013-B
GDNF recombinant human Fisher Scientific (Gibco) 10679963
GlutaMax 100x Gibco 35050038 L-glutamine
Glutaraldehyde grade Sigma-Aldrich G5882-50ML
Heparin sodium cell Sigma-Aldrich H3149-50KU
Human BDNF Fisher Scientific (Gibco) 11588836
Iscove (IMDM) Biochrom FG0465
Laminin mouse Fisher Scientific (Gibco) 10267092
Lead citrate Sigma-Aldrich 15326-25G
Luna FL Automated Cell Counter Biozym 872040 Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.
MACS Buffer Miltenyi 130-091-221
MEM NEAA 100x Gibco 11140035
MiniMACS Trennsäulen Miltenyi 130-042-201
Morada digital camera Olympus
Multiplatte Nunclon 4 wells Fisher Scientific 10507591
N2 Supplement 100x Fisher Scientific (Gibco) 11520536
Neurobasal Medium Gibco 10888022
PBS sterile Roth 9143.2
Poly-L-ornithine Sigma-Aldrich P4957-50ML
Super Glue-3 Loctite Henkel
TEM FEI Technai G2 Spirit FEI Europe
Ultracut UC-6 Leica
Uranyl acetate C EMS 22400

References

  1. Peng, J., Zeng, X. The Role of Induced Pluripotent Stem Cells in Regenerative Medicine: Neurodegenerative Diseases. Stem Cell Research and Therapy. 2 (4), 32 (2011).
  2. Sorells, S. F., et al. Human hippocampal neurogenesis drops sharply in children to undetectable levels in adults. Nature. 555 (7696), 377-381 (2018).
  3. Thomson, J. A., et al. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  4. Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells From Adult Human Fibroblast by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  5. Liu, G. -. H., Yi, F., Suzuki, K., Qu, J., Izpisua Belmonte, J. C. Induced neural stem cells: a new tool for studying neural development and neurological disorders. Cell Research. 22 (7), 1087-1091 (2012).
  6. Becker-Kojić, Z. A., et al. Activation by ACA Induces Pluripotency in Human Blood Progenitor Cells. Cell Technologies in Biology and Medicine. 2, 85-101 (2013).
  7. Marchenko, S., Flanagan, L. Immunocytochemistry: Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. , e267 (2007).
  8. Becker-Kojić, Z. A., et al. A novel glycoprotein ACA is upstream regulator of human heamtopoiesis. Cell Technologies in Biology and Medicine. 2, 69-84 (2013).
  9. Li, D., et al. Neurochemical Regulation of the Expression and Function of Glial Fibrillary Acidic Protein in Astrocytes. Glial. 68 (5), 878-897 (2020).
  10. Melková, K., et al. Structure and Functions of Microtubule Associated Proteins Tau and MAP2c: Similarities and Differences. Biomolecules. 9 (3), 105 (2019).
  11. Menezes, J. R., Luskin, M. B. Expression of neuron-specific tubulin defines a novel population in the proliferative layers of the developing telencephalon. Journal of Neuroscience. 14 (9), 5399-5416 (1994).
  12. Bernal, A., Arranz, L. Nestin-expressing progenitor cells: function, identity and therapeutic implications. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (12), 2177-2195 (2018).

Play Video

Cite This Article
Becker-Kojić, Z. A., Schott, A., Zipančić, I., Hernández-Rabaza, V. GM-Free Generation of Blood-Derived Neuronal Cells. J. Vis. Exp. (168), e61634, doi:10.3791/61634 (2021).

View Video