نحن نقدم بروتوكولا لتوليد DYT الدوائية / بارك ATP1A3 نموذج الماوس خلل التوتر عن طريق زرع cannulas في العقد القاعدية والمخيخ متصلة مضخات التناضح. نحن وصف التعريفي من حركات مثل خلل التوتر عن طريق تطبيق التحدي الحركي وتوصيف النمط الظاهري عبر أنظمة التهديف السلوكية.
تواجه نماذج الماوس المعدلة وراثياً قيوداً، خاصة عند دراسة اضطرابات الحركة، حيث لا تقدم معظم نماذج القوارض المعدلة وراثياً المتاحة نمطاً ظاهرياً محركياً يشبه الجوانب السريرية للمرض البشري. تسمح نماذج الماوس الدوائية بإجراء دراسة أكثر مباشرة للالكوام وتأثيرها على النمط الظاهري السلوكي. مضخات التناضح المتصلة cannulas الدماغ فتح إمكانية إنشاء نماذج الماوس الدوائية عن طريق تسليم المخدرات المحلية والمزمنة. لاضطراب الحركة الوراثية من خلل التوتر السريع الظهور- باركنسونية، والطفرة فقدان وظيفة في الوحدة الفرعية α3 من Na+/ K+-ATPase يمكن محاكاة من قبل حصار محدد للغاية عن طريق ouabain جليكوسايد. من أجل منع محليا α3-subunit في ganglia القاعدية والمخبل المخيخ، والتي هي اثنين من هياكل الدماغ يعتقد أن تشارك بشكل كبير في التسبب في خلل التوتر السريع بداية باركنسونيا، كانولا ثنائية هو زرع stereotaxically في المخطط ويتم إدخال cannula واحد إضافي في المخيخ. ترتبط الكانولاات عبر أنابيب الفينيل إلى مضختين نُمويتين ، يتم زرعهما تحت الجلد على ظهر الحيوانات وتسمحان بتوصيل الوابين بشكل مزمن ودقيق. نموذج الماوس الدوائية لخلل التوتر السريع الظهور-باركنسونيا يحمل ميزة إضافية من تلخيص الميزات السريرية والمرضية من ناقلات الطفرات أعراض وأعراض. تماما مثل ناقلات الطفرات من مرض باركنسونيونيا سريع الظهور، الفئران أوابين pertoned تطوير حركات مثل خلل التوتر فقط بعد التعرض إضافية للإجهاد. نحن نبرهن على نموذج الإجهاد المعتدل وإدخال اثنين من أنظمة التهديف المعدلة لتقييم النمط الظاهري المحرك.
مزايا تسليم المخدرات المستمر مباشرة إلى الدماغ عديدة. يمكن تجنب الحقن المتكرر والمتكرر ، الذي يمثل عامل إجهاد غير ضروري للحيوانات ، ويمكن تحقيق تركيز داخلي أكثر ثباتًا للدواء. هذا صحيح خاصة عندما تفشل الأدوية تدار بشكل نظامي لاختراق بسهولة حاجز الدم في الدماغ. وعلاوة على ذلك، تسليم الأدوية المزمنة عن طريق مضخات التناضح يسمح للتسليم المترجمة من ركائز التي لولا ذلك سيكون لها آثار جانبية على نطاق المنظومة. يمكن تسليم الأدوية بطريقة مستهدفة إلى هياكل الدماغ المطلوبة ، وبالتالي يمكن تتبع التأثير الناتج مباشرة. ويمكن استخدام هذا لمجموعة من التطبيقات، مثل دراسة الآثار العلاجية، فضلا عن دراسة الميكانيكا الباثومية. تم استخدام هذا التطبيق الأخير في المشروع هنا من أجل إنشاء نموذج الماوس الدوائية لخلل التوتر.
تحليل وفهم المتلازمات خلل التوتر، والتي تمثل ثالث أكثر اضطراب الحركة شيوعا، وقد تم محدودة بشدة من حقيقة أن نماذج الحيوانات الوراثية تفشل إلى حد كبير في إعادة إنتاج النمط الظاهري للمرض وجدت في الإنسان المريض وكذلك الفيزيولوجيا المرضية. لا تقتصر هذه المسألة على المتلازمات خلل التوتر، ولكن في الواقع تتعلق العديد من نماذج القوارض المعدلة وراثيا في مجال اضطرابات الحركة1,2. قد يكون السبب في عدم وجود نمط ظاهري في نماذج القوارض المعدلة وراثيا على آليات تعويضية فعالة للغاية3. في حالة خلل التوتر ، يتميز المرض بتقلصات العضلات اللاإرادية مما تسبب في حركات التواء ومواقف غير طبيعية4. وقد ساعدت دراسة الأسباب الثانوية (أي، إصابة الدماغ) من أعراض خلل التوتر، لتحديد الهياكل المشاركة في مظاهر هذه التشوهات الحركية، مثل العقد القاعدية5. وقد أظهرت دراسات التصوير الدماغ من أشكال وراثية من خلل التوتر تشوهات وظيفية في جميع مناطق الدماغ تقريبا المسؤولة عن التحكم في الحركة و الاندماج sensorimotor6,7. ومع ذلك ، لا تزال هناك حاجة إلى نماذج القوارض لتعميق فهم الاختلالات العصبية على مستوى الشبكة الجزيئية والكبيرة وكذلك لتطوير الخيارات العلاجية. هذا هو المكان الذي تقدم نماذج الماوس الدوائية إمكانية تكرار السمات السريرية والمرضية للمرض بطريقة أكثر دقة.
خلل التوتر السريع في الزحم الرعاش (DYT/PARK-ATP1A3؛ RDP; DYT12) هي واحدة من أشكال وراثية من خلل التوتر. وهو ناتج عن طفرات فقدان الوظائف في جين ATP1α3، الذي يقوم بترميز الوحدة الفرعية α3 لNa+/ K+-ATPase8. وعلاوة على ذلك، فمن المسلم به أن ناقلات الطفرات الجينية يمكن أن تكون خالية من الأعراض لسنوات قبل النامية الحادة خلل التوتر المستمر العام وباركنسونية بعد التعرض لحدث مجهد. في الواقع ، فإن penetrance من DYT / PARK – ATP1A3 غير مكتملة ومرهقة الأحداث التي تعمل على نطاق الزناد من الإفراط في المادية ودرجات الحرارة القصوى إلى الإفراط في استهلاك الكحول والالتهابات9،10. من أجل دراسة DYT/PARK-ATP1A3 والعثور على تدخلات علاجية محتملة، فقد حاول عدة مرات تقليد تطور المرض المعتمد على الإجهاد في نماذج القوارض. ومع ذلك ، وبصرف النظر عن واحد القائمة الوراثية DYT / PARK – ATP1A3 نموذج الماوس ، حيث كانت تسبب حركات عابرة غير طبيعية والتشنج مثل انخفاض حرارة الجسم ، وجميع النماذج الماوس الجينية المنشورة لDYT / بارك – ATP1A3 فشلت في إنتاج أعراض خلل التوتر1،11،12. كالديرون وآخرون أظهرت سابقا أن منع α3-subunit ثنائيا في العقد القاعدية والمخيخ عبر واباين جليكوسايد القلب في الفئران من النوع البرية النتائج في اضطراب مشية خفيفة13. أدى التعرض الإضافي لصدمات القدم الكهربائية في بيئة دافئة إلى نمط ظاهري مائل للحرارة وبطء، مما يدل على أن الضخ المزمن والمستهدف للوابين متبوعاً بالإجهاد يقلد بنجاح النمط الظاهري DYT/PARK-ATP1A3.
ومع ذلك ، فإن تعريض الحيوانات لصدمات القدم الكهربائية في بيئة دافئة من 38-40 درجة مئوية على مدى فترة ساعتين يحفز الألم والقلق في الحيوانات ، والتي تمثل عوامل مربكة ، خاصة لتقييم التغيرات في نظام الكاتيتشولامين المتعلقة بتطور خلل التوتر. وهكذا، نحن هنا وصف نوع مختلف من نموذج الإجهاد مع قيمة ترجمة عالية، والتي تتعلق مرة أخرى إلى حقيقة أن خفيفة إلى معتدلة ممارسة وصفت بأنها مشغلات في DYT/PARK-ATP1A3 المرضى9. وعلاوة على ذلك، ممارسة المتكررة هو الزناد المعروفة لخلل التوتر البؤري14. تعرضت الفئران مرارا وتكرارا لمهام حركية صعبة تتألف من ثلاثة ينحدر من قطب خشبي (“اختبار القطب”) وثلاثة أشواط على جهاز Rotarod (“اختبار الأداء Rotarod”). تم استخدام وضع الحيوانات على الجزء العلوي من عمود خشبي 50 سم لإجبار الحيوانات على النزول ، تم استخدام جهاز Rotarod لإخضاع الفئران للنشاط القسري عن طريق وضعها على قضيب دوار.
توصيف النمط الظاهري المحرك لنموذج الماوس لخلل التوتر هو تحد خاص بسبب عدم وجود اختبارات محددة مسبقا ودرجات. ومع ذلك، فقد تم استخدام اختلاف واحد من تقييم الإعاقة الحركية مرارا وتكرارا على مدى السنوات الماضية من أجل تقييم شدة وتوزيع الحركات مثل خلل التوتر في القوارض13،15،16. نحن هنا تقديم نسخة معدلة من مقياس تصنيف خلل التوتر، والتي أثبتت فعاليتها في تقييم النمط الظاهري مثل خلل التوتر الحيواني عندما لوحظ على مدى فترة زمنية قدرها أربع دقائق. كطريقة ثانية لتقييم حركات مثل خلل التوتر، نقدم نظام تسجيل تم تطويره حديثًا لتقييم الحركات غير الطبيعية أثناء اختبار تعليق الذيل. وهو يسمح لتقييم وتيرة ومدة حركات مثل خلل التوتر والمواقف من الأطراف الأمامية، hindlimbs وكذلك الجذع.
هذا DYT / PARK -ATP1A3 نموذج الماوس الدوائية يسمح للتحليل المفصل للتغيرات الهيكلية والعصبية الكيميائية intracerral الناجمة فقط عن تثبيط أيونات الصوديوم والبوتاسيوم في العقد القاعدية و المخيخ وكذلك التعديلات المتعلقة التعرض للإجهاد. في حالة الفئران ، يمكن زرع مضختين من التناضح تحت الجلد كحد أقصى. نحن هنا نقدم طريقة بالتفصيل تسليم المخدرات المزمنة لهياكل الدماغ متعددة من خلال تنفيذ قنية مزدوجة متصلة بمحول التشعب بالإضافة إلى قنية واحدة. ويمكن استخدام هذه المنهجية لأي تطبيق يتطلب تركيب هياكل متعددة للدماغ في آن واحد وبشكل مزمن.
نقدم نموذج فأر لاضطراب حركة نادرة، حيث يصاب المرضى بالأعراض الدائمة بعد التعرض للإجهاد. ولا يزال هذا التفاعل الجيني والبيئي المفترض غير مفهوم جيداً، ولكنه قد يمثل أحد الميكانيكا الباثومية الرئيسية في تطوير DYT/PARK-ATP1A3. وقد نشرت أساليب مختلفة من تعريض الفئران للإجهاد في الماضي وتشمل الصدمات القدم الكهربائية، وكبح، والبيئة الباردة أو الدافئة والتعرض لمختلف الروائح11،12،13. في محاولة لتعرض الفئران إلى عامل إجهاد خفيف ذو قيمة تحويلية ، فإننا هنا نصف الخضوع المتكرر للفئران للمهام الحركية الصعبة. بالنسبة لاختبار القطب، كشفت الحيوانات المُشبعة بالوعين عن فرط الإفراط في الأطراف الأمامية و hindlimbs. وكانت هذه الحركات مشابهة جدا للحركات التي تشبه خلل التوتر لوحظت خلال تسجيل الفيديو 4 دقائق من الحيوانات وكذلك اختبار تعليق الذيل. قد يكون تطبيق الإجهاد الخفيف في شكل مهام حركية صعبة مفيدًا في نماذج الماوس الأخرى التي تظهر الأعراض الحركية أو الانعجاب العصبي ، حيث تؤثر التفاعلات الجينية البيئية بشكل كبير على درجة تطور المرض.
هناك نقص عام في المهام السلوكية المحددة مسبقا، فضلا عن جداول التصنيف لتصنيف الحركات غير الطبيعية والمواقف في الفئران. معظم المهام الحركية المتاحة تكشف عن تشوهات غير محددة، مثل المشبك hindlimb، وهي ظاهرة معروفة في العديد من نماذج الماوس من اضطرابات الحركة مع تنكس عصبي18،19. من أجل توصيف مناسب للنمط الظاهري ، من الضروري تحليل ما إذا كان نموذج الماوس يلخص السمات البارزة للمرض. هنا، نقدم نسخة معدلة من مقياس تصنيف خلل التوتر المستخدمة سابقا لتقييم الإعاقة الحركية في نماذج الماوس خلل التوتر15،16. بالإضافة إلى ذلك قمنا بتطوير نظام تسجيل قائم على المراقبين لاختبار تعليق الذيل ، والذي تم إنشاؤه بشكل مماثل لموازين التصنيف السريري لخلل التوتر البشري. ويظهر كلا المقياسين تصنيف درجة أعلى بكثير في ouabain- مُزَدَّد الفئران، مقارنة مع الوعين المُلَكَّن، والحيوانات غير المجهدة، فضلاً عن الحيوانات المُلَكَّبة بالمركبات. وتتمثل عيوب أي نظام للتسجيل قائم على المراقبين في التدريب اللازم لمقيّبي التقييم لضمان اتساق التهديف والحد من تقلب المراقبين، فضلا عن خطر التحيز المحتمل للمصنّف إن لم يكن أعمى تماما عن المجموعة التي تم تحليلها. ومع ذلك، لا تزال أنظمة التسجيل القائمة على المراقبين تقدم طريقة سهلة المنال لتوصيف النمط الظاهري ويمكن تكييفها مع نموذج الفأرة المحلل، كما هو الحال في المشروع الحالي لتقييم الحركات الشبيهة بخلل التوتر. لضمان اتساق التسجيل بين مختلف المُقيّـّـن، ينبغي إتاحة مقاطع فيديو تدريبية. للحد من أي تحيز محتمل ، فمن المستحسن أن تقييم مختلفة تسجيل نفس مقاطع الفيديو ، وأن يتم متوسط الدرجات الفردية. كل من أنظمة التهديف المذكورة في هذا العمل سجل وجود حركات مثل خلل التوتر في الحيوانات. يمكن تكييف موازين التصنيف وفقًا لمتطلبات محددة داخل المشروع ، كما تم ذلك سابقًا من قبل Ip et al.، حيث تم تسجيل hindlimbs فقط للحركات الشبيهة بخلل التوتر في نموذج ماوس لخلل التوتر 1 (DYT-TOR1A)20. ويمكن استكمال موازين التصنيف من خلال أنظمة تسجيل أخرى منشورة سابقًا ، وتقييم درجة البطء في القوارض على سبيل المثال كما تم مع درجة الإعاقة في الحركة بواسطة Calderon et al.13.
The authors have nothing to disclose.
وقد تم دعم هذا العمل من قبل وزارة التعليم والبحوث الاتحادية (BMBF DysTract إلى C.W.I.) والمركز متعدد التخصصات للبحوث السريرية (IZKF) في جامعة فورتسبورغ (Z2-CSP3 إلى L.R.). يشكر المؤلفون لويزا فريك، وكيالي روهم، وفيرونيكا سنغر، وهايكه مينزيل، وعلى مساعدتهم التقنية، وكذلك هيلغا برونر على رعاية الحيوانات.
0.9% saline | Fresenius Kabi | PZN06178437 | |
Alzet osmotic pumps | Durect | 4317 | model 1002, flowrate 0.25 μL/h |
Anchor Screws | AgnTho's | MCS1x2 | 2 mm long with a thread of 1mm O.D. |
Bulldog Clamps | Agntho's | 13-320-035 | straight, 3.5 cm |
Bupivacain 0.25% Jenapharm | mibe GmbH Arzneimittel | ||
Cannula and Minipump Holder | Stoelting | 51636 | designed to hold 3.4 mm cannula heads |
Cannula Bifurcation | Plastics One | 21Y | custom made |
Cannula tubing | Plastics One | C312VT/PKG | vinyl, 0.69 mm x 1.14 mm |
Dumont #5SF forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | fine forceps |
eye cream Bepanthen | Bayer Vital GmbH | ||
Gas Anesthesia Mask for Stereotaxic, Mouse | Stoelting | 56109M | |
Hardened fine scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
High Speed Rotary Micromotor Kit | Foredom | K.1070-2 | |
Isoflurane CP 1 mL/mL, 250 mL | cp-pharma | 1214 | prescription needed |
Isoflurane System Dräger Vapor 19.3 | Dr. Wilfried Müller GmbH | ||
Kallocryl A/C | Speiko | 1615 | dental cement, liquid |
Kallocryl CPGM rot | Speiko | 1692 | dental cement, red powder |
Mouse and neonates adaptor | Stoelting Co. | 51625 | adaptor for mice for a traditional U-frame |
needle holder | KLS Martin Group | 20-526-14 | |
Non-Rupture Ear Bars and Rubber Tips f/ Mouse Stereotaxic | Stoelting Co. | 51649 | |
Octenisept | Schülke | 118211 | |
Osmotic Pump Connector Cannula for Mice, double | Plastics One | 3280PD-3.0/SPC | 28 Gauge, length 4.0 mm, c/c distance 3.0 mm |
Osmotic Pump Connector Cannula for Mice, single | Plastics One | 3280PM/SPC | 28, Gauge, custom length 3.0 mm |
Ouabain octahydrate 250 mg | Sigma-Aldrich | 03125-250MG | CAUTION: toxic |
Precision balance | Kern & Sohn | PFB 6000-1 | |
Rectal Thermal Probe | Stoelting | 50304 | |
Rimadyl 50 mg/mL, injectable | Zoetis | Carprofen, prescription needed | |
Rodent Warmer X1 with Mouse Heating Pad | Stoelting | 53800M | |
RotaRod Advanced | TSE Systems | ||
screw driver set | Agntho's | 30090-6 | |
Stainless Steel Burrs | Agntho's | HM71009 | 0.9 mm Ø burr |
Stainless Steel Burrs | Agntho's | HM71014 | 1.4 mm Ø burr |
StereoDrive | Neurostar | software | |
Stereotaxic instrument | Stoelting Co. | custom made by Neurostar | |
Stereotaxic robot | Neurostar | ||
suture: coated vicryl, polyglatin 910 | Ethicon | V797D | |
ThermoMixer C | Eppendorf AG | 5382000015 |