Wij bieden een protocol voor het genereren van een farmacologische DYT /PARK-ATP1A3 dystonie muis model via implantatie van canules in basale ganglia en cerebellum aangesloten op osmotische pompen. We beschrijven de inductie van dystonie-achtige bewegingen via toepassing van een motorische uitdaging en de karakterisering van het fenotype via gedragsscoresystemen.
Genetisch gemodificeerde muismodellen worden geconfronteerd met beperkingen, vooral bij het bestuderen van bewegingsstoornissen, waarbij de meeste beschikbare transgene knaagdiermodellen geen motorisch fenotype presenteren dat lijkt op de klinische aspecten van de menselijke ziekte. Farmacologische muismodellen zorgen voor een meer directe studie van de pathomechanismen en hun effect op het gedragsfenotype. Osmotische pompen aangesloten op hersenblikjes openen de mogelijkheid om farmacologische muismodellen te maken via lokale en chronische medicijnlevering. Voor de erfelijke bewegingsstoornis van snel beginnende dystonie-parkinsonisme kan de verlies-van-functie mutatie in de α3-subunit van de Na+/K+-ATPase worden gesimuleerd door een zeer specifieke blokkade via de glycoside ouabain. Om lokaal de α3-subunit in de basale ganglia en het cerebellum te blokkeren, die de twee hersenstructuren zijn waarvan wordt aangenomen dat ze sterk betrokken zijn bij de pathogenese van snel beginnende dystonie-parkinsonisme, wordt een bilateraal canule stereotaxically geïmplanteerd in het striatum en wordt een extra enkele canule in het cerebellum geïntroduceerd. De canules zijn via vinylbuizen verbonden met twee osmotische pompen, die onderhuids op de rug van de dieren worden geïmplanteerd en de chronische en nauwkeurige levering van ouabain mogelijk maken. Het farmacologische muismodel voor snel beginnende dystonie-parkinsonisme draagt het bijkomende voordeel van het hervatten van de klinische en pathologische kenmerken van asymptomatische en symptomatische mutatiedragers. Net als mutatiedragers van snel beginnende dystonie parkinsonisme, ontwikkelen de door ouabain-perfused muizen dystonie-achtige bewegingen pas na extra blootstelling aan stress. We tonen een mild stressparadigma en introduceren twee gewijzigde scoresystemen voor de beoordeling van een motorisch fenotype.
De voordelen van een continue drug levering rechtstreeks in de hersenen zijn talrijk. Repetitieve en frequente injecties, die een onnodige stressfactor voor dieren vertegenwoordigen, kunnen worden vermeden en een constantere intracerebrale concentratie van het medicijn kan worden bereikt. Dit is vooral geldig wanneer systemisch toegediende geneesmiddelen niet gemakkelijk doordringen in de bloed-hersenbarrière. Bovendien, chronische drug levering via osmotische pompen zorgt voor de gelokaliseerde levering van substraten die anders systeem-brede bijwerkingen zou hebben. De medicijnen kunnen gericht worden geleverd aan de gewenste hersenstructuren, het resulterende effect kan dus direct worden getraceerd. Dit kan worden gebruikt voor een scala aan toepassingen, zoals de studie van therapeutische effecten, evenals de studie van pathomechanisms. Deze laatste toepassing werd gebruikt in het project hierin om een farmacologische muis model voor dystonie te creëren.
De analyse en het begrip van dystonische syndromen, die de derde meest voorkomende bewegingsstoornis vertegenwoordigen, zijn sterk beperkt door het feit dat genetische diermodellen grotendeels niet de ziekte fenotype reproduceren die bij zieke menselijke evenals pathofysiologie wordt gevonden. Deze kwestie is niet beperkt tot dystonische syndromen, maar betreft in feite veel transgene knaagdiermodellen op het gebied van bewegingsstoornissen1,2. De reden voor het ontbreken van een fenotype in transgene knaagdiermodellen zou gebaseerd kunnen zijn op zeer effectieve compenserende mechanismen3. In het geval van dystonie wordt de ziekte gekenmerkt door onwillekeurige spiercontracties die draaiende bewegingen en abnormale houdingen veroorzaken4. De studie van secundaire oorzaken (d.w.z. hersenletsel) van dystonische symptomen, heeft geholpen om de structuren te identificeren die betrokken zijn bij de manifestatie van deze motorische afwijkingen, zoals de basale ganglia5. Hersenbeeldvormingsstudies van erfelijke vormen van dystonie hebben functionele afwijkingen aangetoond in bijna alle hersengebieden die verantwoordelijk zijn voor motorische controle en sensorimotorische integratie6,7. Knaagdiermodellen zijn echter nog steeds nodig om het begrip van de neurale disfuncties op moleculair en grootschalig netwerkniveau en voor de ontwikkeling van therapeutische opties te verdiepen. Dit is waar farmacologische muismodellen de mogelijkheid bieden om de klinische en pathologische kenmerken van een ziekte nauwkeuriger te repliceren.
Snel beginnende dystonie-parkinsonisme (DYT/PARK-ATP1A3; RDP; DYT12) is een van de erfelijke vormen van dystonie. Het wordt veroorzaakt door verlies-van-functie mutaties in het ATP1α3-gen, dat codeert voor de α3-subunit van de Na+/K+-ATPase8. Bovendien wordt erkend dat genmutatiedragers jarenlang vrij kunnen zijn van symptomen voordat ze een blijvende gegeneraliseerde dystonie en parkinsonisme kunnen ontwikkelen na blootstelling aan een stressvolle gebeurtenis. Inderdaad, de penetrance van DYT/PARK-ATP1A3 is onvolledige en stressvolle gebeurtenissen die fungeren als een trigger variëren van fysieke overexertion en extreme temperaturen tot overconsumptie van alcohol en infecties9,10. Om DYT/PARK-ATP1A3 te bestuderen en potentiële therapeutische interventies te vinden, is het vele malen geprobeerd om de stress-afhankelijke ziekteontwikkeling in knaagdiermodellen na te bootsen. Afgezien van het bestaande genetische DYT/PARK-ATP1A3 muismodel, waarbij voorbijgaande abnormale en stuiptrekkingsachtige bewegingen werden veroorzaakt door onderkoeling, zijn alle gepubliceerde genetische muismodellen voor DYT/PARK-ATP1A3 er niet in geslaagd dystonische symptomen te produceren1,11,12. Calderon et al. eerder aangetoond dat het blokkeren van de α3-subunit bilateraal in de basale ganglia en het cerebellum via de cardiale glycoside ouabain in wilde type muizen resulteert in milde loop verstoring13. De extra blootstelling aan elektrische voetschokken in een warme omgeving leidde tot een dystonisch en bradykinetisch fenotype, wat aantoont dat chronische en gerichte perfusie van ouabain gevolgd door stress met succes het DYT/PARK-ATP1A3 fenotype imiteert.
Het blootstellen van dieren aan elektrische voetschokken in een warme omgeving van 38-40 °C gedurende een periode van twee uur veroorzaakt echter pijn en angst bij dieren, die verstorende factoren zijn, met name voor de beoordeling van veranderingen in het catecholaminesysteem in verband met de ontwikkeling van dystonie. Zo beschrijven we hierin een ander soort stress paradigma met een hoge translationele waarde, die betrekking heeft op het feit dat milde tot matige oefening zijn beschreven als triggers in DYT / PARK-ATP1A3 patiënten9. Bovendien is repetitieve oefening een bekende trigger voor focale dystonie14. Muizen werden herhaaldelijk onderworpen aan uitdagende motorische taken bestaande uit drie afdalingen van een houten paal (“paaltest”) en drie runs op een Rotarod-apparaat (“Rotarod-prestatietest”). De plaatsing van dieren op de top van een 50 cm houten paal werd gebruikt om de dieren af te dwingen om af te dalen, het Rotarod-apparaat werd gebruikt om muizen te onderwerpen aan gedwongen activiteit door ze op een roterende staaf te plaatsen.
De karakterisering van het motorfenotype van een muismodel voor dystonie is bijzonder uitdagend vanwege het gebrek aan vooraf gedefinieerde tests en scores. De afgelopen jaren is echter herhaaldelijk een variatie van een beoordeling van motorische handicaps gebruikt om de ernst en de verdeling van dystonie-achtige bewegingen bij knaagdieren13,15,16te evalueren . We presenteren hierin een aangepaste versie van de dystonie rating schaal, die effectief bleek te zijn bij het evalueren van de dystonie-achtige fenotype van dieren wanneer waargenomen over een periode van vier minuten. Als tweede methode voor het beoordelen van dystonie-achtige bewegingen presenteren we een nieuw ontwikkeld scoresysteem voor de beoordeling van abnormale bewegingen tijdens een staartsuspensietest. Het maakt de beoordeling van de frequentie en duur van dystonie-achtige bewegingen en houdingen van de voorste ledematen, achterpoten en romp.
Dit DYT/PARK-ATP1A3 farmacologische muismodel maakt de gedetailleerde analyse mogelijk van intracerebrale structurele en neurochemische veranderingen die uitsluitend worden veroorzaakt door remming van de natriumkaliumionenpomp in de basale ganglia en cerebellum, alsmede veranderingen in verband met stressblootstelling. In het geval van muizen kunnen maximaal twee osmotische pompen onderhuids worden geïmplanteerd. We presenteren hierin een methode die chronische medicijnlevering aan meerdere hersenstructuren detailert door een dubbele canule te implementeren die is aangesloten op een bifurcatieadapter naast een enkele canule. Deze methodologie kan worden gebruikt voor elke toepassing die vereist meerdere hersenstructuren gelijktijdig en chronisch worden geperfundeerd.
We presenteren een muismodel van een zeldzame bewegingsstoornis, waarbij patiënten blijvende symptomen ontwikkelen na blootstelling aan stress. Deze veronderstelde gen-milieu interactie is nog steeds niet goed begrepen, maar kan een van de belangrijkste pathomechanismen in DYT / PARK-ATP1A3 ontwikkeling. Verschillende methoden om muizen bloot te stellen aan stress zijn in het verleden gepubliceerd en omvatten elektrische voetschokken, een beperking, koude of warme omgeving en blootstelling aan verschillende geuren11,12,13. In een poging om muizen bloot te stellen aan een milde stressfactor met translationele waarde, beschrijven we hierin de repetitieve onderwerping van muizen aan uitdagende motorische taken. Voor de pooltest, ouabain-perfused dieren bleek onvrijwillige hyperextensie van de voorste ledematen en achterpoten. Deze bewegingen waren zeer vergelijkbaar met de dystonie-achtige bewegingen waargenomen tijdens de 4-min video-opname van de dieren en de staart schorsing test. De toepassing van milde stress in de vorm van uitdagende motorische taken kan nuttig zijn in andere muismodellen met motorische symptomen of neurodegeneratie, waarbij gen-milieu-interacties de mate van ziekteprogressie enorm beïnvloeden.
Er is een algemeen gebrek aan vooraf gedefinieerde gedragstaken en beoordelingsschalen om abnormale bewegingen en houdingen bij muizen te classificeren. De meeste beschikbare motorische taken onthullen niet-specifieke afwijkingen, zoals achterpootsluiting, wat een bekend fenomeen is in veel muismodellen van bewegingsstoornissen met neurodegeneratie18,19. Voor de juiste karakterisering van een fenotype is het echter noodzakelijk om te analyseren of het muismodel de meest opvallende kenmerken van de ziekte samenvat. Hierin presenteren we de aangepaste versie van een dystonie rating schaal die eerder werd gebruikt voor de beoordeling van motorische handicap in dystonie muis modellen15,16. Daarnaast ontwikkelden we een op waarnemer gebaseerd scoresysteem voor de staartsuspensietest, die op dezelfde manier werd vastgesteld als de klinische beoordelingsschalen van menselijke dystonie. Beide ratingschalen vertonen een aanzienlijk hogere score bij door ouabain-perfused, gestreste muizen in vergelijking met door ouabain-perfused, niet-gestreste dieren en door voertuigen geperfundeerde dieren. De nadelen van elk op waarnemers gebaseerd scoresysteem zijn de noodzakelijke opleiding van beoordelaars om een consistente score te garanderen en de variabiliteit van de waarnemer te verminderen, alsmede het gevaar van een mogelijke vooringenomenheid van de rater, indien deze niet volledig verblind is voor de geanalyseerde groep. Echter, waarnemer-gebaseerde scoring systemen presenteren nog steeds een gemakkelijk toegankelijke methode om een fenotype te karakteriseren en kan worden aangepast aan de muis model geanalyseerd, zoals gedaan in het huidige project voor de beoordeling van dystonie-achtige bewegingen. Om een consistente score tussen de verschillende bepelaars te garanderen, moeten trainingsvideo’s beschikbaar worden gesteld. Om eventuele vooroordelen te verminderen, wordt aanbevolen dat verschillende beoordelaars dezelfde videoclips scoren en dat de individuele scores gemiddeld zijn. Beide scoresystemen die in dit werk worden genoemd, registreren de aanwezigheid van dystonie-achtige bewegingen bij dieren. De classificatieschalen kunnen worden aangepast aan de specifieke vereisten binnen een project, zoals eerder gedaan door Ip et al., waar uitsluitend de achterpoten werden gescoord voor dystonie-achtige bewegingen in een muismodel voor dystonie 1 (DYT-TOR1A)20. De rating schalen kunnen worden aangevuld met andere eerder gepubliceerde scoring systemen, het beoordelen van bijvoorbeeld de mate van bradykinesia bij knaagdieren zoals gedaan met de locomotion invaliditeit score door Calderon et al.13.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door het Federale Ministerie van Onderwijs en Onderzoek (BMBF DysTract aan C.W.I.) en door het Interdisciplinair Centrum voor Klinisch Onderzoek (IZKF) van de Universiteit van Würzburg (Z2-CSP3 naar L.R.). De auteurs danken Louisa Frieß, Keali Röhm, Veronika Senger en Heike Menzel en voor hun technische bijstand en Helga Brünner voor de dierenverzorging.
0.9% saline | Fresenius Kabi | PZN06178437 | |
Alzet osmotic pumps | Durect | 4317 | model 1002, flowrate 0.25 μL/h |
Anchor Screws | AgnTho's | MCS1x2 | 2 mm long with a thread of 1mm O.D. |
Bulldog Clamps | Agntho's | 13-320-035 | straight, 3.5 cm |
Bupivacain 0.25% Jenapharm | mibe GmbH Arzneimittel | ||
Cannula and Minipump Holder | Stoelting | 51636 | designed to hold 3.4 mm cannula heads |
Cannula Bifurcation | Plastics One | 21Y | custom made |
Cannula tubing | Plastics One | C312VT/PKG | vinyl, 0.69 mm x 1.14 mm |
Dumont #5SF forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | fine forceps |
eye cream Bepanthen | Bayer Vital GmbH | ||
Gas Anesthesia Mask for Stereotaxic, Mouse | Stoelting | 56109M | |
Hardened fine scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
High Speed Rotary Micromotor Kit | Foredom | K.1070-2 | |
Isoflurane CP 1 mL/mL, 250 mL | cp-pharma | 1214 | prescription needed |
Isoflurane System Dräger Vapor 19.3 | Dr. Wilfried Müller GmbH | ||
Kallocryl A/C | Speiko | 1615 | dental cement, liquid |
Kallocryl CPGM rot | Speiko | 1692 | dental cement, red powder |
Mouse and neonates adaptor | Stoelting Co. | 51625 | adaptor for mice for a traditional U-frame |
needle holder | KLS Martin Group | 20-526-14 | |
Non-Rupture Ear Bars and Rubber Tips f/ Mouse Stereotaxic | Stoelting Co. | 51649 | |
Octenisept | Schülke | 118211 | |
Osmotic Pump Connector Cannula for Mice, double | Plastics One | 3280PD-3.0/SPC | 28 Gauge, length 4.0 mm, c/c distance 3.0 mm |
Osmotic Pump Connector Cannula for Mice, single | Plastics One | 3280PM/SPC | 28, Gauge, custom length 3.0 mm |
Ouabain octahydrate 250 mg | Sigma-Aldrich | 03125-250MG | CAUTION: toxic |
Precision balance | Kern & Sohn | PFB 6000-1 | |
Rectal Thermal Probe | Stoelting | 50304 | |
Rimadyl 50 mg/mL, injectable | Zoetis | Carprofen, prescription needed | |
Rodent Warmer X1 with Mouse Heating Pad | Stoelting | 53800M | |
RotaRod Advanced | TSE Systems | ||
screw driver set | Agntho's | 30090-6 | |
Stainless Steel Burrs | Agntho's | HM71009 | 0.9 mm Ø burr |
Stainless Steel Burrs | Agntho's | HM71014 | 1.4 mm Ø burr |
StereoDrive | Neurostar | software | |
Stereotaxic instrument | Stoelting Co. | custom made by Neurostar | |
Stereotaxic robot | Neurostar | ||
suture: coated vicryl, polyglatin 910 | Ethicon | V797D | |
ThermoMixer C | Eppendorf AG | 5382000015 |