Genetisk variantdetektering i CALR-genet ved hjælp af smeltningsanalyse med høj opløsning

Summary

Høj opløsning smelteanalyse (HRM) er en følsom og hurtig løsning til genetisk variant afsløring. Det afhænger af sekvensforskelle, der resulterer i, at heterodplexer ændrer smeltekurvens form. Ved kæmning HRM og agarose gel elektroforese, forskellige typer af genetiske varianter såsom indels kan identificeres.

Abstract

Høj opløsning smelteanalyse (HRM) er en kraftfuld metode til genotyping og genetisk variation scanning. De fleste HRM-applikationer er afhængige af mættende DNA-farvestoffer, der registrerer sekvensforskelle, og heterodoplekter, der ændrer formen på smeltekurven. Fremragende instrumentopløsning og speciel dataanalysesoftware er nødvendig for at identificere de små smeltekurveforskelle, der identificerer en variant eller genotype. Forskellige typer af genetiske varianter med forskellige frekvenser kan observeres i genet, der er specifikke for patienter med en bestemt sygdom, især kræft og i CALR-genet hos patienter med Philadelphia-negative myeloproliferative neoplasmer. Enkelte nukleotidændringer, indsættelser og/eller sletninger (indels) i interessegen kan detekteres ved HRM-analysen. Identifikationen af forskellige typer genetiske varianter er for det meste baseret på de kontroller, der anvendes i qPCR HRM-analysen. Men efterhånden som produktlængden øges, bliver forskellen mellem vilde og heterozygote kurver mindre, og typen af genetisk variant er vanskeligere at bestemme. Derfor, hvor indels er den fremherskende genetiske variant forventes i genet af interesse, en ekstra metode såsom agarose gel elektroforese kan anvendes til afklaring af HRM resultat. I nogle tilfælde skal et usikkert resultat re-kontrolleres / re-diagnosticeret af standard Sanger sekventering. I denne retrospektive undersøgelse anvendte vi metoden på JAK2 V617F-negative patienter med MPN.

Introduction

Somatiske genetiske varianter i calreticulingen (CALR) blev anerkendt i 2013 hos patienter med myeloproliferative neoplasmer (MPN) såsom essentiel trombocythemia og primær myelofibrosis^1,2. Siden da er mere end 50 genetiske varianter i CALR-genet blevet opdaget, hvilket fremkalder et +1 (−1+2) frameshift³. De to hyppigste CALR genetiske varianter er en 52 bp sletning (NM_004343,3 (CALR):c.1099_1150del52, p.(Leu367Thrfs *46)), også kaldet type 1 mutation, og en 5 bp indsættelse (NM_004343,3 (CALR):c.1154_1155insTTGTC, s.(Lys385Asnfs *47)), også kaldet type 2 mutation. Disse to genetiske varianter repræsenterer 80% af alle CALR genetiske varianter. De andre er blevet klassificeret som type 1-lignende eller type 2-lignende ved hjælp af algoritmer baseret på bevarelsen af en α helix tæt på vilde type CALR⁴. Her præsenterer vi en af de meget følsomme og hurtige metoder til CALR genetisk variantdetektering, smelteanalysemetoden med høj opløsning (HRM). Denne metode muliggør hurtig påvisning af genetiske varianter af type 1 og type 2, som repræsenterer størstedelen af CALR-mutationer ⁵. HRM blev indført i kombination med realtid »polymerase kædereaktion« (qPCR) i 1997 som et redskab til at opdage mutationen i faktor V Leiden⁶. I forhold til Sanger sekventering, der repræsenterer den gyldne standard teknik, HRM er en mere følsom og mindre specifik metode⁵. HRM-metoden er en god screeningsmetode, der muliggør en hurtig analyse af et stort antal prøver med en stor cost-benefit⁵. Det er en simpel PCR-metode udført i nærværelse af et fluorescerende farvestof og kræver ikke specifikke færdigheder. En anden fordel er, at selve proceduren ikke beskadiger eller ødelægger den analyserede prøve, der giver os mulighed for at genbruge prøven til elektroforese eller Sanger sekventering efter HRM-proceduren⁷. Den eneste ulempe er, at det nogle gange er vanskeligt at fortolke resultaterne. Derudover registrerer HRM ikke den nøjagtige mutation hos patienter med ikke-type 1- eller type 2-mutationer⁸. Hos disse patienter skal Sanger sekventering udføres (Figur 1).

HRM er baseret på forstærkning af den specifikke DNA-region i nærværelse af mættende DNA fluorescerende farvestof, som er indarbejdet i dobbeltstrenget DNA (dsDNA). Det fluorescerende farvestof udsender lys, når det er indarbejdet i dsDNA. Efter en gradvis temperaturstigning nedbrydes dsDNA i enkeltstrenget DNA, som kan påvises på smeltekurven som et pludseligt fald i fluorescensintensiteten. Formen af smeltekurven afhænger af den DNA-sekvens, der bruges til at opdage mutationen. Smeltekurver af prøver sammenlignes med smeltekurver af kendte mutationer eller vilde type CALR. Forskellige smeltekurver repræsenterer en anden mutation, der ikke er type 1 eller type 2⁹.

Algoritmen til den somatiske genetiske variantdetektering i CALR-genet ved HRM, agarosegelelektroforese og sekventeringsmetode (Figur 1) blev anvendt og valideret i den retrospektive undersøgelse, der blev offentliggjort før¹⁰.

Protocol

Undersøgelsen blev godkendt af Republikken Sloveniens Komité for Medicinsk Etik. Alle procedurer var i overensstemmelse med Helsinki-erklæringen. 1. Fluorescensbaseret kvantitativ pcr i realtid (qPCR) og post-qPCR-analyse foretaget af HRM Genanvendelige primere, der er anført i materialetabellen, til 100 μM med steril, RNase og DNasefri H2O (se materialetabel). Lav en 10 μM arbejdskoncentrationsgrunder. Primere, der anvendes i protok…

Representative Results

Den vellykkede DNA-region af interesse med en eksponentiel stigning i fluorescens, der overstiger tærsklen mellem cyklusser 15 og 35 og meget snævre værdier af kvantificeringscyklussen (Cq) i alle replikerede prøver og kontroller (figur 2), er en forudsætning for pålidelig identifikation af genetiske varianter ved HRM-analyse. Dette opnås ved at anvende en præcis bestemmelse af DNA med fluorescensfarvning og en lige stor mængde DNA i qPCR HRM-eksperimentet (se trin 1.2). <strong cla…

Discussion

Høj opløsning smeltning af DNA er en simpel løsning til genotyping og genetisk variant scanning¹⁴. Det afhænger af sekvensforskelle, der resulterer i heterodplexer, der ændrer formen på smeltekurven. Forskellige typer af genetiske varianter med forskellige frekvenser kan observeres i genet, der er specifikke for en bestemt gruppe patienter med kræft^{1,2,15,16,…}

Materials

E-Gel EX 4% Agarose	Invitrogen, Thermo Fischer Scientific	G401004
Fuorometer 3.0 QUBIT	Invitrogen, Thermo Fischer Scientific	Q33216
Invitrogen E-Gel iBase and E-Gel Safe Imager Combo Kit	Invitrogen, Thermo Fischer Scientific	G6465EU
MeltDoctor HRM MasterMix 2X	Applied Biosystem, Thermo Fischer Scientific	4415440	Components: AmpliTaqGold 360 DNA Polymerase, MeltDoctor trade HRM dye, dNTP blend including dUTP, Magnesium salts and other buffer components, precisely formulated to obtain optimal HRM results
MicroAmp Fast 96-well Reaction Plate (0.1 mL)	Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific	4346907
MicroAmp Optical adhesive film	Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific	4311971
NuGenius	Syngene	NG-1045	Gel documentation systems
Primer CALRex9 Forward	Eurofins Genomics		Sequence: 5'GGCAAGGCCCTGAGGTGT'3 (High-Purity, Salt-Free)
Primer CALRex9 Reverse	Eurofins Genomics		Sequence: 5'GGCCTCAGTCCAGCCCTG'3 (High-Purity, Salt-Free)
QIAamp DNA Mini Kit	QIAGEN	51306	DNA isolation kit with the buffer for DNA dilution.
Qubit Assay Tubes	Invitrogen, Thermo Fischer Scientific	Q32856
QUBIT dsDNA HS assay	Invitrogen, Thermo Fischer Scientific	Q32854
Trackit 100bp DNA Ladder	Invitrogen, Thermo Fischer Scientific	10488058	Ladder consists of 13 individual fragments with the reference bands at 2000, 1500, and 600 bp.
ViiA7 Real-Time PCR System	Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific	4453534
Water nuclease free	VWR, Life Science	436912C	RNase, DNase and Protease free water