Détection de variantes génétiques dans le gène CALR à l’aide d’une analyse de fusion à haute résolution

Summary

L’analyse de fusion à haute résolution (HRM) est une solution sensible et rapide pour la détection de variantes génétiques. Cela dépend des différences de séquence qui entraînent des hétéroduplexes modifiant la forme de la courbe de fusion. En peignant la GRH et l’électrophorèse sur gel d’agarose, différents types de variantes génétiques telles que les indels peuvent être identifiés.

Abstract

L’analyse de fusion à haute résolution (HRM) est une méthode puissante pour le génotypage et le balayage de variation génétique. La plupart des applications hrm dépendent de colorants ADN saturés qui détectent les différences de séquence et d’hétéroduplexes qui modifient la forme de la courbe de fusion. Une excellente résolution d’instrument et un logiciel spécial d’analyse des données sont nécessaires pour identifier les petites différences de courbe de fusion qui identifient une variante ou un génotype. Différents types de variantes génétiques avec des fréquences diverses peuvent être observés dans le gène spécifique pour les patients atteints d’une maladie spécifique, en particulier le cancer et dans le gène CALR chez les patients atteints de néoplasmes myéloprolifératifs négatifs du chromosome Philadelphie. Des changements, des insertions et/ou des délétions (indels) d’un seul nucléotide dans le gène d’intérêt peuvent être détectés par l’analyse HRM. L’identification des différents types de variantes génétiques est principalement basée sur les contrôles utilisés dans le test qPCR HRM. Cependant, à mesure que la longueur du produit augmente, la différence entre les courbes de type sauvage et les courbes hétérozygotes devient plus petite et le type de variante génétique est plus difficile à déterminer. Par conséquent, lorsque les indels sont la variante génétique prévalente attendue dans le gène d’intérêt, une méthode supplémentaire telle que l’électrophorèse sur gel d’agarose peut être utilisée pour clarifier le résultat de la GRH. Dans certains cas, un résultat non concluant doit être revérifié/rediagnostiqué par séquençage de Sanger standard. Dans cette étude rétrospective, nous avons appliqué la méthode à des patients JAK2 V617F négatifs atteints de NPP.

Introduction

Des variantes génétiques somatiques du gène de la calréticuline(CALR)ont été reconnues en 2013 chez des patients atteints de néoplasmes myéloprolifératifs (NPP) tels que la thrombocytémie essentielle et la myélofibrose primaire^1,2. Depuis lors, plus de 50 variantes génétiques du gène CALR ont été découvertes, induisant un décalage de trame +1 (−1+2)^3. Les deux variantes génétiques CALR les plus fréquentes sont une délétion de 52 pb (NM_004343,3 (CALR):c.1099_1150del52,p. (Leu367Thrfs*46)), également appelée mutation de type 1, et une insertion de 5 pb (NM_004343,3 (CALR): c.1154_1155insTTGTC, p. (Lys385Asnfs*47)), également appelée mutation de type 2. Ces deux variantes génétiques représentent 80 % de toutes les variantes génétiques du CALR. Les autres ont été classés comme de type 1 ou de type 2 en utilisant des algorithmes basés sur la préservation d’une hélice α proche du type sauvage CALR^4. Nous présentons ici l’une des méthodes très sensibles et rapides pour la détection des variantes génétiques CALR, la méthode d’analyse de fusion à haute résolution (HRM). Cette méthode permet la détection rapide des variantes génétiques de type 1 et de type 2, qui représentent la majorité des mutations CALR ^5. La GRH a été introduite en combinaison avec la « réaction en chaîne par polymérase » (qPCR) en temps réel en 1997 en tant qu’outil de détection de la mutation dans le facteur V de Leiden^6. Par rapport au séquençage de Sanger qui représente la technique de référence, la GRH est une méthode plus sensible et moins spécifique^5. La méthode HRM est une bonne méthode de criblage qui permet une analyse rapide d’un grand nombre d’échantillons avec un grand rapport coût-bénéfice⁵. Il s’agit d’une méthode pcr simple réalisée en présence d’un colorant fluorescent et ne nécessitant pas de compétences spécifiques. Un autre avantage est que la procédure elle-même n’endommage ni ne détruit l’échantillon analysé, ce qui nous permet de réutiliser l’échantillon pour l’électrophorèse ou le séquençage de Sanger après la procédure HRM⁷. Le seul inconvénient est qu’il est parfois difficile d’interpréter les résultats. De plus, HRM ne détecte pas la mutation exacte chez les patients présentant des mutations non de type 1 ou de type 2⁸. Chez ces patients, un séquençage de Sanger doit être effectué (Figure 1).

La GRH est basée sur l’amplification de la région spécifique de l’ADN en présence d’un colorant fluorescent saturé d’ADN, qui est incorporé dans l’ADN double brin (dsDNA). Le colorant fluorescent émet de la lumière lorsqu’il est incorporé dans l’ADNds. Après une augmentation progressive de la température, l’ADNds se décompose en ADN simple brin, qui peut être détecté sur la courbe de fusion comme une diminution soudaine de l’intensité de fluorescence. La forme de la courbe de fusion dépend de la séquence d’ADN utilisée pour détecter la mutation. Les courbes de fusion des échantillons sont comparées aux courbes de fusion de mutations connues ou de type sauvage CALR. Les courbes de fusion distinctes représentent une mutation différente qui n’est pas de type 1 ou de type 2⁹.

L’algorithme de détection de la variante génétique somatique dans le gène CALR par GRH, électrophorèse sur gel d’agarose et méthode de séquençage (Figure 1) a été utilisé et validé dans l’étude rétrospective publiée avant^{le 10.}

Protocol

L’étude a été approuvée par le Comité d’éthique médicale de la République de Slovénie. Toutes les procédures étaient conformes à la déclaration d’Helsinki. 1. PCR quantitative en temps réel (qPCR) basée sur la fluorescence et analyse post-qPCR par HRM Remettre en suspension les apprêts énumérés dans le tableau des matériaux à 100 μM avec H2Ostérile, sans RNase et sans DNase (voir tableau des matériaux). Prépa…

Representative Results

La région d’intérêt de l’ADN amplifié avec une augmentation exponentielle de la fluorescence qui dépasse le seuil entre les cycles 15 et 35 et des valeurs très étroites du cycle de quantification (Cq) dans tous les échantillons et témoins répliqués(Figure 2)est une condition préalable à l’identification fiable des variantes génétiques par analyse HRM. Ceci est réalisé en utilisant une détermination précise de l’ADN avec coloration par fluorescence et une quantité …

Discussion

La fusion à haute résolution de l’ADN est une solution simple pour le génotypage et le balayage des variantes^{génétiques 14}. Cela dépend des différences de séquence qui entraînent des hétéroduplexes qui modifient la forme de la courbe de fusion. Différents types de variantes génétiques avec des fréquences diverses peuvent être observés dans le gène spécifique pour un certain groupe de patients atteints de cancer^1,2…

Materials

E-Gel EX 4% Agarose	Invitrogen, Thermo Fischer Scientific	G401004
Fuorometer 3.0 QUBIT	Invitrogen, Thermo Fischer Scientific	Q33216
Invitrogen E-Gel iBase and E-Gel Safe Imager Combo Kit	Invitrogen, Thermo Fischer Scientific	G6465EU
MeltDoctor HRM MasterMix 2X	Applied Biosystem, Thermo Fischer Scientific	4415440	Components: AmpliTaqGold 360 DNA Polymerase, MeltDoctor trade HRM dye, dNTP blend including dUTP, Magnesium salts and other buffer components, precisely formulated to obtain optimal HRM results
MicroAmp Fast 96-well Reaction Plate (0.1 mL)	Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific	4346907
MicroAmp Optical adhesive film	Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific	4311971
NuGenius	Syngene	NG-1045	Gel documentation systems
Primer CALRex9 Forward	Eurofins Genomics		Sequence: 5'GGCAAGGCCCTGAGGTGT'3 (High-Purity, Salt-Free)
Primer CALRex9 Reverse	Eurofins Genomics		Sequence: 5'GGCCTCAGTCCAGCCCTG'3 (High-Purity, Salt-Free)
QIAamp DNA Mini Kit	QIAGEN	51306	DNA isolation kit with the buffer for DNA dilution.
Qubit Assay Tubes	Invitrogen, Thermo Fischer Scientific	Q32856
QUBIT dsDNA HS assay	Invitrogen, Thermo Fischer Scientific	Q32854
Trackit 100bp DNA Ladder	Invitrogen, Thermo Fischer Scientific	10488058	Ladder consists of 13 individual fragments with the reference bands at 2000, 1500, and 600 bp.
ViiA7 Real-Time PCR System	Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific	4453534
Water nuclease free	VWR, Life Science	436912C	RNase, DNase and Protease free water