고해상도 용융 분석(HRM)은 유전적 이체 검출을 위한 민감하고 신속한 솔루션입니다. 그것은 이발 곡선의 모양을 변경 하는 heteroduplexes 귀착되는 시퀀스 차이에 따라 달라 집니다. HRM 및 아가로즈 젤 전기전도를 빗질함으로써, 인델과 같은 유전적 변이체의 상이한 유형을 확인할 수 있다.
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이 논문에서
요약
초록
고해상도 용융 분석(HRM)은 유전화 및 유전적 변이 스캐닝을 위한 강력한 방법입니다. 대부분의 HRM 응용 프로그램은 서열 차이를 감지하는 DNA 염료를 포화시키고 용융 곡선의 모양을 변경하는 이테로두플렉스에 의존합니다. 우수한 계측기 해상도와 특수 데이터 분석 소프트웨어는 변형 또는 유전자형을 식별하는 작은 용융 곡선 차이를 식별하는 데 필요합니다. 다양한 주파수를 가진 유전 이체의 다른 모형은 특정 질병을 가진 환자를 위해 특정한 유전자에서 관찰될 수 있습니다, 특히 암 및 필라델피아 염색체-음성 골수증성 신생물을 가진 환자에 있는 CALR 유전자에서. 관심 유전자의 단일 뉴클레오티드 변화, 삽입 및/또는 삭제(indels)는 HRM 분석에 의해 검출될 수 있다. 유전 이체의 다른 모형의 확인은 주로 qPCR HRM 분석에서 사용된 통제에 근거를 두릅니다. 그러나 제품 길이가 증가함에 따라 야생형곡선과 이종조곡선의 차이가 작아지고 유전적 변이체의 유형이 결정되기 가 더 어려워진다. 따라서, 인델이 관심 있는 유전자에서 예상되는 널리 퍼진 유전적 이체인 경우, 아가로즈 겔 전기포진과 같은 추가 방법이 HRM 결과의 해명에 사용될 수 있다. 경우에 따라 표준 Sanger 시퀀싱에 의해 결정적인 결과를 다시 검사/다시 진단해야 합니다. 이 회고 연구에서, 우리는 MPN을 가진 JAK2 V617F 음성 환자에 방법을 적용했습니다.
서론
calreticulin유전자(CALR)의체세포 유전 변이체는 2013년에 필수 혈전세포증 및 1차 골수혈증과같은 골수증성 신생물(MPN)을 가진 환자에서1,2를인식하였다. 그 이후로 CALR 유전자에 있는 50개 이상의 유전 변이체가 발견되어 +1(−1+2) 프레임 시프트3을유도합니다. 가장 빈번한 CALR 유전변이체 는 52bp 삭제(NM_004343.3(CALR):c.1099_1150del52, p.(Leu367Thrfs*46)) 및 타입-1 돌연변이라고도 하며, 5bp 삽입(NM_004343.3(CALR):c.1154_1155insTTGTC, p.(lys385Asnfs*47))라고도 합니다. 이 2개의 유전 이체는 모든 CALR 유전 이체의 80%를 나타냅니다. 다른 것들은 야생형 CALR4에가까운 α 나선의 보존에 기초한 알고리즘을 사용하여 유형 1-like 또는 유형 2-와 같은 유형으로 분류되었습니다. 여기서, 우리는 CALR 유전이체 검출을 위한 고민감하고 신속한 방법 중 하나인 ....
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프로토콜
연구 결과는 슬로베니아 공화국의 의학 윤리위원회에 의해 승인되었습니다. 모든 절차는 헬싱키 선언에 따른 것입니다.
1. HRM에 의한 형광 기반 정량적 실시간 PCR(qPCR) 및 사후 qPCR 분석
- 재료 표에 나열된 프라이머를 멸균, RNase 및 DNase 무료 H2O로 100 μM로 재일시 중지합니다(재료 표참조). 10 μM 작업 농도 프라이머를 만듭니다. 프로토콜에 사용된 프라이머는2이전에 게시되었습니다.
- 제조업체의 지시 에 따른 형광 염색 방법에 의한 DNA 의 양수과립세포(재료표 참조). 10m Tris-Cl, 0.5 mM EDTA, pH 9.0을 사용하여 20 ng/μL DNA 용액을 준비한다(재료표참조).
- DNA 샘플 이외에, 적어도 세 가지 DNA 컨트롤을 준비: NM_004343.3(CALR)와두 개의 양성 대조군 : c.1099_1150del52, p.(Leu367Thrfs*46) (52bp 삭제 또는 타입 1 돌연변이), 및 NM....
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결과
모든 복제된 샘플 및 대조군(그림2)에서주기 15및 35 사이의 임계값과 매우 좁은 값사이의 임계값을 초과하는 형광의 기하급수적 증가와 함께 성공적으로 증폭된 DNA 영역은 HRM 분석에 의한 유전적 이체의 신뢰성 있는 식별을 위한 전제 조건이다. 이것은 형광 염색을 가진 DNA의 정확한 측정 및 qPCR HRM 실험에 있는 DNA의 동등한 양을 사용하여 달성됩니다 (단계 1.2 참조). 도 2는 모든 샘플 및 컨트롤의 Cq 값이 매우 좁은 간격에 있는 관심 있는 DNA 영역의 성공적인 증폭을 나타낸다. NTC 우물에는 증폭이 없습니다.
HRM 단계는 1.11 단계에서 설명된 프로토콜을 사용하여 qPCR 직후에 수행됩니다. 시료의 활성 용융영역(그림 3,레이블(c)은, 컨트롤 및 NTC는 정렬된 용융 곡선 플롯(도
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토론
DNA의 고해상도 용융은 유전화 및 유전 적 변이체 스캐닝14에대한 간단한 솔루션이다. 그것은 용융 곡선의 모양을 변경 하는 heteroduplexes 귀착되는 시퀀스 차이에 따라 달라 집니다. 다양한 주파수를 가진 유전이체의 상이한유형은 암1, 2,15,16,10을가진 환자의 특정 집단에 대한 유전자에서 관찰될 수 있다. 관심 있는 유전자내의 삭제 또는 삽입은 도 4A에도시된 바와 같이 HRM 분석에 의해 검출될 수 있다. 일상적인 시험에 qPCR HRM 분석의 구현에서, 우리는 63 년의 중간 나이 (24에서 90 년 범위)의 중간 나이를 가.......
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공개 사항
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
저자는 전문 혈액학 연구소, 혈액학학과, 내과, 대학 의료 센터 류블랴나의 모든 학술 전문가와 직원에게 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| E-Gel EX 4% 아가로스 | 인비트로젠, Thermo Fischer Scientific | G401004 | |
| 형광계 3.0 QUBIT | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | Q33216 | |
| Invitrogen E-Gel iBase 및 E-Gel Safe Imager 콤보 키트 | , Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | G6465EU | |
| MeltDoctor HRM MasterMix 2X | Applied Biosystem, Thermo Fischer Scientific | 4415440 | 구성 요소: AmpliTaqGold 360 DNA 중합효소, MeltDoctor trade HRM 염료, dUTP를 포함한 dNTP 혼합물, 마그네슘 염 및 기타 완충 성분, 최적의 HRM 결과를 얻기 위해 정밀하게 제조됨 |
| MicroAmp Fast 96-well 반응 플레이트(0.1 mL) | Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific | 4346907 | |
| MicroAmp 광학 접착 필름 | Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific | 4311971 | |
| NuGenius | Syngene | NG-1045 | 겔 문서화 시스템 |
| 프라이머 CALRex9 Forward | Eurofins 유전체학 | 염기서열: 5'GGCAAGGCCCTGAGGTGT'3 (고순도, 무염) | |
| 프라이머 CALRex9 Reverse | Eurofins Genomics | Sequence: 5'GGCCTCAGTCCAGCCCTG'3 (High-Purity, Salt-Free) | |
| QIAamp DNA Mini Kit QIAGEN | 51306 | DNA 희석을 위한 완충액이 있는 DNA 분리 키트. | |
| Qubit Assay Tubes | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | Q32856 | |
| QUBIT dsDNA HS 어세이 | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | Q32854 | |
| Trackit 100bp DNA Ladder | Invitrogen, Thermo Fischer Scientific | 10488058 | Ladder는 2000, 1500 및 600 bp의 기준 대역을 가진 13개의 개별 단편으로 구성되어 있습니다. |
| ViiA7 Real-Time PCR 시스템 | 응용 바이오시스템, Thermo Fischer Scientific | 4453534 | |
| 물 뉴클레아제 무함유 | VWR, 생명 과학 | 436912C | RNase, DNase 및 프로테아제 무함유 정제수 |
참고문헌
- Nangalia, J., et al. Somatic CALR mutations in myeloproliferative neoplasms with nonmutated JAK2. New England Journal of Medicine. 369, 2391-2405 (2013).
- Klampfl, T., et al. Somatic mutations of calreticulin in myeloproli....
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