Summary
Este documento describe un nuevo protocolo de dosimetría para las irradiaciones celulares utilizando equipos de rayos X de baja energía. Las mediciones se realizan en condiciones que simulan condiciones reales de irradiación celular tanto como sea posible.
Abstract
La importancia de los protocolos de dosimetría y las normas para los estudios radiobiológicos es evidente. Se han propuesto varios protocolos para la determinación de dosis utilizando instalaciones de rayos X de baja energía, pero dependiendo de las configuraciones de irradiación, muestras, materiales o calidad del haz, a veces es difícil saber qué protocolo es el más adecuado para emplear. Por lo tanto, proponemos un protocolo de dosimetría para las irradiaciones celulares utilizando instalaciones de rayos X de baja energía. El objetivo de este método es realizar la estimación de la dosis a nivel de la monocapa celular para que sea lo más cerca posible de las condiciones reales de irradiación celular. Los diferentes pasos del protocolo son los siguientes: determinación de los parámetros de irradiación (alta tensión, intensidad, contenedor celular, etc.), determinación del índice de calidad del haz (pareja de capa de medio valor de alto voltaje-medio), medición de la velocidad de dosis con cámara de ionización calibrada en condiciones de kerma de aire, cuantificación de la atenuación y dispersión del medio de cultivo celular con películas radiocromáticas EBT3, y determinación de la velocidad de dosis a nivel celular. Esta metodología debe realizarse para cada nueva configuración de irradiación celular, ya que la modificación de un solo parámetro puede afectar fuertemente la deposición de dosis real a nivel de la monocapa celular, particularmente con rayos X de baja energía.
Introduction
El objetivo de la radiobiología es establecer vínculos entre la dosis administrada y los efectos biológicos; la dosimetría es un aspecto crucial en el diseño de experimentos radiobiológicos. Durante más de 30 años, se ha destacado la importancia de las normas de dosimetría y la armonización de las prácticas1,2,3,4,5. Para establecer una referencia de velocidad de dosis, existen varios protocolos6,7,8,9,10; sin embargo, como lo demuestran Peixoto y Andreo11, puede haber diferencias de hasta el 7% dependiendo de la cantidad dosimétrica utilizada para la determinación de la tasa de dosis. Además, incluso si existen protocolos, a veces es difícil saber qué protocolo es el más adecuado para una aplicación en particular, si existe, porque la tasa de dosis de las células depende de parámetros como el contenedor de células, la cantidad de medios de cultivo celular o la calidad del haz, por ejemplo. La dispersión y el backscattering para este tipo de irradiación es también un parámetro muy importante a tener en cuenta. De hecho, para los rayos X de baja y media energía, en el protocolo de referencia AAPM TG-6110,la dosis absorbida en agua se mide en la superficie de un fantasma del agua. Teniendo en cuenta las condiciones de irradiación celular muy específicas, el pequeño volumen de medios de cultivo celular rodeados de aire está más cerca de las condiciones de kerma que los definidos para una dosis absorbida con un fantasma equivalente de agua grande como en el protocolo TG-61. Por lo tanto, hemos optado por utilizar el kerma en agua como una cantidad dosimétrica para referencia en lugar de la dosis absorbida en agua. Por lo tanto, proponemos un nuevo enfoque para proporcionar una mejor determinación de la dosis real administrada a las células.
Además, otro aspecto crucial para los estudios radiobiológicos es la presentación completa de los métodos y protocolos utilizados para la irradiación con el fin de poder reproducir, interpretar y comparar resultados experimentales. En 2016, Pedersen et al.12 destacó la inadecuada notificación de dosimetría en estudios radiobiológicos preclínicos. Un estudio reciente más amplio de Draeger et al.13 destacó que aunque se notifican algunos parámetros de dosimetría como la dosis, la energía o el tipo de fuente, falta una gran parte de los parámetros de física y dosimetría que son esenciales para replicar correctamente las condiciones de irradiación. Esta revisión a gran escala, de más de 1.000 publicaciones que abarcan los últimos 20 años, muestra una falta significativa de informes de las condiciones de física y dosimetría en estudios radiobiológicos. Por lo tanto, una descripción completa del protocolo y el método utilizado en los estudios radiobiológicos es obligatorio con el fin de tener experimentos robustos y reproducibles.
Teniendo en cuenta estos diferentes aspectos, para los experimentos radiobiológicos llevados a cabo en el IRSN (Instituto de Protección radiológica y Seguridad Nuclear), se implementó un estricto protocolo para las irradiaciones celulares en una instalación de ortovoltaje. Este protocolo de dosimetría fue diseñado con el fin de simular las condiciones reales de irradiación celular tanto como sea posible y, por lo tanto, para determinar la dosis real administrada a las células. Para ello, se enumeran todos los parámetros de irradiación y se evaluó el índice de calidad del haz midiendo la capa de medio valor (HVL) para la que se han realizado algunas adaptaciones, ya que no se pueden seguir las recomendaciones estándar del protocolo AAPM10. La medición absoluta de la tasa de dosis se realizó entonces con la cámara de ionización dentro del recipiente celular utilizado para las irradiaciones celulares, y la atenuación y la dispersión de los medios de cultivo celular también se cuantificó con películas radiocromáticas EBT3. Como la modificación de un solo parámetro del protocolo puede afectar significativamente a la estimación de la dosis, se realiza una dosimetría dedicada para cada configuración de irradiación celular. Además, el valor HVL debe calcularse para cada combinación de filtro de voltaje. En este trabajo actual, se utiliza una tensión de 220 kV, una intensidad de 3 mA, y una filtración inherente y adicional de 0,8 mm y 0,15 mm de berilio y cobre, respectivamente. La configuración de irradiación celular elegida se encuentra en un matraz T25, donde las células fueron irradiadas con 5 ml de medios de cultivo celular.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Plataforma de irradiación y determinación de parámetros de irradiación
- Utilice una plataforma de irradiación que ofrezca rayos X de baja a media energía. Determine los parámetros del experimento para garantizar la robustez y la reproducibilidad del experimento radiobiológico: Alta tensión, Intensidad, Filtración (inherente y adicional), Capa de medio valor (HVL), Energía efectiva, Detector utilizado para mediciones de dosimetría, Distancia de muestra de origen (SSD), Campo de irradiación (forma, tamaño, geometría), Cantidad de dosimetría, Método de dosimetría, Tasa de dosis, Contenedor de celda y Cantidad de medios de cultivo celular. Todos los parámetros utilizados en este protocolo se indican en la Tabla 1.
2. Índice de calidad del haz: determinación de la capa de medio valor
NOTA: El HVL se define como el espesor de un atenuador (generalmente cobre o aluminio) para reducir la intensidad de la viga en un factor de dos en comparación con el valor original.
- Configure el equipo (soporte, colimador, diafragma, ionización) dentro de la carcasa de irradiación siguiendo las instrucciones de la Figura 1. No se utiliza ningún material atenuador en este paso.
- Asegúrese de que todas las distancias notificadas en la Figura 1 sean correctas. Mida estos con una cinta métrica.
- Coloque esa cámara de ionización en la posición horizontal. Para este trabajo, utilizamos una cámara de ionización cilíndrica 31002 (equivalente a 31010) calibrada en kerma de aire.
- Pre-irradiar la cámara de ionización durante 5 min y medir el fondo (este paso se puede realizar sin un colimador).
- Realice 10 mediciones de 1 min cada una en modo de recogida de carga correspondiente al valorraw M (en coulombs).
- Tome la temperatura y la presión con el equipo calibrado adecuado colocado dentro de la carcasa de irradiación en nuestro caso (si no es posible, colóquelo cerca del experimento). Corrija la lecturaM raw en el electrometro por el factor de corrección de temperatura y presión dado de la siguiente manera:
donde: T (°C) y P (hPa) son la temperatura y la presión reales, respectivamente. Tref y Pref son la temperatura de referencia y la presión cuando la ionización fue calibrada por el laboratorio de estándares. La presión y la temperatura deben medirse con instrumentos calibrados. El valor obtenido en el modo de carga es el valor medio de referencia M (en coulombs).
NOTA: Este paso no es estrictamente necesario para la medición HVL, pero se recomienda. - Coloque un atenuador de cierto grosor por encima del diafragma. El conjunto HVL se compone de láminas con diferentes espesores (0,02, 0,05, 0,1, 0,2, 0,5, 1, 2, 5 y 10 mm de cobre) con una dimensión que permite cubrir aquí toda la viga (80 x 80 mm).
- Tome una medida de 1 min (Mraw corregido por el KT,P como se describió anteriormente).
- Si la tasa de dosis se divide por un factor de 2 con respecto al valor inicial, se encuentra el valor HVL. Tome 5 mediciones de 1 min para estimar la tasa media de dosis.
- Si la tasa de dosis no se divide por un factor de 2 con respecto al valor inicial, aumente o disminuya el grosor del atenuador y tome otra medida. Ajuste el grosor del atenuador según sea necesario.
- Una vez que se encuentre el grosor del atenuador que disminuye la intensidad del haz por un factor dos, tome 5 mediciones de 1 min para confirmar el HVL.
NOTA: En la mayoría de los casos, el grosor exacto del atenuador no se puede encontrar en las láminas disponibles. En este caso, proceda por bisección e interpole el HVL.
3. Evaluación del campo de irradiación (sin estimación de dosis)
- Coloque una película EBT3 en el soporte utilizado para la irradiación.
- Irradia esta película para obtener un campo de irradiación bien marcado (al menos 2 Gy).
- Escanee la película EBT3 con un escáner dedicado.
- Trace el perfil de dosis utilizando la imagen J utilizando la opción Analizar y, a continuación, Trazar perfil (Figura 2).
- Determinar el tamaño del uso del campo de irradiación para la irradiación (área homogénea, excluyendo las regiones del penumbra, véase la Figura 2).
- Realice marcas en el soporte utilizado para la irradiación para asegurarse de que el contenedor de celdas está en la posición correcta.
NOTA: En este paso, se determina el tamaño del campo de irradiación y no se estima la dosis. El procedimiento completo para la lectura y el análisis de películas se indica en la sección 5. Además, tome los márgenes para evitar errores debido al posicionamiento del contenedor de la célula.
4. Medición de la tasa de dosis con cámara de ionización
- Tome el recipiente de celda y rompa una pequeña parte en el lado o en la parte inferior (dependiendo del contenedor particular y la cámara de ionización utilizada) para poder colocar la cámara de ionización dentro(Figura 3,sección superior) o debajo(Figura 3,sección inferior) del contenedor. Los ejemplos se dan en la Figura 3 con diferentes cámaras de ionización (cilíndricas o planas paralelas) y contenedores de celdas. En este caso, se utilizó un matraz T25(Figura 3,caja roja).
NOTA: un soldador o bisturí calentado es una buena alternativa para hacer agujeros en los utensilios de plástico - Coloque el recipiente dentro de la carcasa en el soporte utilizado para la irradiación (placa de carbono aquí).
- Coloque la cámara de ionización en el recipiente(Figura 3,caja roja), en la posición correcta y conéctelo al electrometro.
- Asegúrese de que todos los parámetros de irradiación enumerados en la sección 1 sean correctos (alto voltaje, intensidad, filtraciones adicionales, distancia de la muestra de origen, etc.).
- Pre-irradiar la cámara de ionización durante 5 min y realizar la reducción a cero del electrometro.
- Tome 10 mediciones de 1 min para determinar la tasa media de dosis en el kerma de aire (Gy.min-1). Calcule la determinación de la velocidad de dosis enel aire K de la siguiente manera:
donde M es la lectura del dosímetro corregido por temperatura, presión, efecto polaridad, recombinación de iones y calibración del electrometro. NKair y Kq son los factores de calibración y corrección de la calidad de la radiación, cuyos valores son específicos de cada cámara de ionización.
5. Medición de la atenuación y dispersión de los medios de cultivo celular
NOTA: Manipule las películas EBT3 con guantes durante todo el procedimiento.
- Preparación del experimento
- Corta pequeñas piezas de películas EBT3 al menos 24 h antes de la irradiación.
- Determine el tamaño de las películas en función del contenedor de celdas utilizado para experimentos de radiobiología (4 x 4 cm para un matraz T25, por ejemplo).
Cortar dos conjuntos de películas radiocromáticas: Un conjunto para las curvas de calibración compuestas por tres piezas de película radiocromática EBT3 por dosis o punto de tiempo (nueve puntos en total para este trabajo); y un conjunto para la cuantificación de la atenuación de los medios de cultivo celular, también tres piezas por punto. - Numere todas las películas para su identificación (esquina superior derecha aquí) y escanee en la misma posición en el escáner.
- Mantenga las películas alejadas de la luz.
- Prepare el contenedor de celdas utilizado para las mediciones de película EBT3 y, si es necesario, corte una pieza para colocar la película dentro (un ejemplo con un T25 se da en la Figura 4).
- Estimación de la tasa de dosis
- Mida la tasa de dosis para la configuración como se describe en la sección anterior.
- Mantenga esta configuración en su lugar para la irradiación de las películas radiocromáticas EBT3 y utilice el mismo tipo de contenedor de células.
- Construcción de la curva de calibración
- Tome las películas EBT3 precortadas para la curva de calibración.
- No irradiar tres piezas (0 Gy).
- Coloque la primera película dentro del contenedor de celdas, en la misma configuración que para la irradiación celular.
- Irradiarlo para obtener los primeros puntos de dosis.
- Repita esta operación para obtener tres piezas de películas EBT3 irradiadas con la misma dosis.
- Realice esto para cada punto de dosis (nueve puntos de dosis en este trabajo (0, 0,25, 0,5, 0,75, 1, 1,5, 2, 2,5 y 3 Gy) como se ilustra en la Figura 5).
- Evaluación de la atenuación de los medios de cultivo celular y dispersión.
- Eligió el mismo tiempo de irradiación para todas las irradiaciones (60 s, por ejemplo).
- Irradia tres piezas de películas EBT3 en el recipiente sin agua.
- Irradia tres piezas de películas EBT3 en el recipiente con agua de la siguiente manera.
- Coloque la película dentro del contenedor.
- Llene el recipiente con la cantidad exacta de agua para representar los medios de cultivo celular (5 ml aquí). Utilice pequeñas piezas de cinta si las películas no permanecen sumergidas correctamente.
- Coloque el recipiente de celda dentro de la carcasa y asegúrese de que la película esté correctamente sumergida.
- Cuando se complete la irradiación, tome las películas EBT3, séquelas con papel absorbente y guárdelas lejos de la luz.
6. Lectura de películas radiocromáticas EBT3
- Lea las películas ebt3 al menos 24 h después de la irradiación.
- Escanea las películas en un escáner dedicado.
- Establezca los parámetros del escáner como: formato tiff rojo-verde-azul de 48 bits, 150 ppp en modo de transmisión y sin corrección de imagen.
- Realice un calentamiento del escáner de la siguiente manera.
- Coloque una película no irradiada en el escáner.
- Inicie una vista previa del análisis.
- Inicie un temporizador y espere 30 s.
- Inicie la exploración.
- Al final de la exploración, inicie un temporizador y espere 90 s.
- Al mismo tiempo, registre el escaneo, abra la imagen con ImageJ, trace un ROI cuadrado (siempre del mismo tamaño y en la misma posición) y realice una medición del nivel medio de píxel rojo de la zona.
- Al final de los años 90, repita el procedimiento desde el paso 2 (sin tocar la película dentro del escáner).
- Repita esto al menos 30 veces para calentar y estabilizar el escáner (sin variaciones en el nivel medio de píxel rojo del área seleccionada en las películas no irradiadas). Si el escáner, es decir, el valor medio del píxel rojo, no se estabiliza, continúe con el procedimiento.
- Escaneo de las películas ebt3
- Coloque la primera película en el centro de la cama del escáner. Delimitar un área para colocar siempre la película en el mismo lugar y en la misma orientación.
- Inicie una vista previa del análisis.
- Inicie un temporizador y espere 30 s.
- Inicie la exploración.
- Al final de la exploración, inicie un temporizador y espere 90 s. Durante estos 90 s cambiar la película EBT3.
NOTA: Un análisis de las películas radiocromáticas EBT3 se realizó utilizando un programa de C++ autoprogramado. Se pueden utilizar diferentes métodos para el análisis de película EBT3, como el método de canal rojo o el método de tres canales14,15. En este caso, hemos utilizado el método del canal rojo sin resta de fondo, y las imágenes se convirtieron en densidades ópticas y luego a la dosis utilizando nuestro programa. Como este método ya está bien definido, nuestro programa de C++ no se incluyó aquí. Además, el software dedicado16 también se puede utilizar para el análisis de películas EBT3.
7. Determinación de la tasa de dosis a nivel de la monocapa celular
- Convierta la tasa media de dosis obtenida con la cámara de ionización corregida por la atenuación y dispersión de los medios de cultivo celular (K) en el kerma de agua utilizando la relación del coeficiente medio de absorción de energía masiva para el agua al aire evaluada sobre el espectro de fluencia del fotón (μen/ρ).
Un software dedicado17 se utilizó para calcular el espectro de energía de fotones en el aire sin fantasma, y utilizamos la tabla NIST18 para calcular el coeficiente medio de absorción de energía masiva.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En este trabajo, utilizamos una plataforma dedicada a la irradiación de animales pequeños19; sin embargo, esta plataforma se puede utilizar para irradiar otros tipos de muestras como las células. La fuente de irradiación es un tubo de rayos X Varian (NDI-225-22) que tiene una filtración inherente de 0,8 mm de berilio, un gran tamaño de deporte focal de 3 mm, un rango de alto voltaje de aproximadamente 30 a 225 kV y una intensidad máxima de 30 mA.
Los parámetros utilizados para este estudio se notifican en la Tabla 1. Hemos elegido mostrar un ejemplo del uso de este protocolo para la irradiación celular en un matraz T25 con 5 ml de medios de cultivo celular.
Capa de medio valor
La Tabla 2 informa de las mediciones realizadas para estimar el espesor del atenuador necesario para disminuir la intensidad del haz en un factor de dos. Para ello, se tomaron 10 mediciones de referencia para estimar la lectura media de Mcrudo en el electrometro (en Coulombs), corregido por el factor de corrección de temperatura y presión (KT,P).
A continuación, se probaron diferentes espesores de atenuadores para encontrar el grosor que disminuyó la intensidad del haz en un factor de dos. Cuando se encontró este espesor, se tomaron cinco mediciones para evaluar elvalor bruto M promedio corregido por KT,P.
Para esta configuración, se encontró una capa de medio valor de 0,667 mm de cobre. A partir de la medición HVL, podemos calcular la energía efectiva del haz, que es de aproximadamente 69 keV en nuestro caso.
Medición de la tasa de dosis
Antes de estas mediciones, se irradiaba una película EBT3 para determinar la superficie en la que el campo de irradiación es homogéneo, lo que nos permite colocar correctamente el recipiente de la célula. Esta área es de aproximadamente 10 x 10 cm² excluyendo las regiones de penumbra mostradas por las líneas de puntos en la Figura 2. Luego, la medición de la velocidad de la dosis se realizó utilizando una cámara de ionización cilíndrica 31002 (equivalente a 31010) calibrada en bordillo de aire. Para esta configuración, con un campo abierto de irradiación de campo a 35 cm de la fuente en un contenedor de células T25 colocado en una placa de carbono, la tasa de dosis fue de aproximadamente 0,626 Gy.min-1 enaireK.
Para determinar la dosis exacta en las células, elaire K medido se convirtió en bordillo de agua. La Figura 5 muestra el espectro de energía de rayos X obtenido con el software dedicado17. A partir de este espectro de energía y la tabla NIST, podemos convertir la tasa de dosis enaire K aaguaK, que fue de 0,659 Gy.min-1.
La incertidumbre general de la medición de la tasa de dosis absoluta fue de aproximadamente el 3% a un nivel de confianza del 95%.
Atenuación y dispersión de los medios de cultivo celular
Para la cuantificación de la atenuación y dispersión de los medios de cultivo celular, se realizaron mediciones de dosimetría con películas radiocromáticas EBT3 a temperatura ambiente. A partir de la medición con la cámara de ionización, se determinó la tasa de dosis. Las películas de calibración se irradiaron en la misma posición. Las películas radiocromáticas EBT3 se calibraron entre 0 y 3 Gy con pasos de 0,25 Gy entre 0 y 1 Gy y 0,5 Gy entre 1 y 3 Gy (nueve puntos de dosis para construir la curva de calibración) como se muestra en la Figura 6. Los puntos de dosis estaban equipados con una curva polinómica de4 grados. Las películas EBT3 fueron irradiadas con y sin la cantidad exacta de medios de cultivo celular dentro del contenedor celular para evaluar la atenuación y la dispersión debido a los medios de cultivo celular. Para esta configuración, la atenuación de los medios de referencia cultural de celda fue de aproximadamente el 1,5%.
La incertidumbre general de las mediciones de la película EBT3 fue de aproximadamente el 4% a un nivel de confianza del 95%.
Mediciones rutinarias
Antes de realizar las irradiaciones celulares, la tasa de dosis se midía cada vez en el mismo recipiente utilizado para la irradiación. Por lo tanto, utilizamos la tasa de dosis diaria para estimar el tiempo de irradiación. Si seguimos de cerca el protocolo y no cambiamos ningún parámetro, la medición HVL y la atenuación debido a los medios de cultivo celular no necesitan repetirse. Como ejemplo, la tabla utilizada para la medición diaria se indica en la Tabla 3.
Figura 1: El esquema de la configuración tiene lugar en el gabinete SARRP para las mediciones HVL. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Evaluación del tamaño del campo de irradiación. Perfil de dosis obtenido a 35 cm de la fuente sin colimador. Las líneas punteadas muestran el área considerada para la irradiación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Fotografías de recipientes celulares con la cámara de ionización para la medición de la tasa de dosis. Parte superior: ejemplo de medición con una cámara de ionización cilíndrica 31002. Parte inferior: ejemplo de medición con una cámara de ionización TM23342. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Fotografías del T25 utilizadas para la medición de la atenuación de los medios de cultivo celular. La parte superior del T25 fue cortada para poder colocar la película dentro del matraz. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Espectros de energía simulados para un alto voltaje de 220 kV con 0,8 mm de Be y 0,15 mm de filtraciones Cu17. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Películas EBT3 irradiadas para construir la curva de calibración y la curva de calibración correspondiente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Alta tensión (kV) | 220 |
| Intensidad (mA) | 3 |
| Filtraciones (inherentes y adicionales) | 0,8 mm de Be + 0,15 mm Cu |
| Capa de medio valor (mm Cu) | Determinado a continuación |
| Energía efectiva (keV) | Determinado a continuación |
| Detector utilizado | Cámara cilíndrica de ionización + películas radiocromáticas EBT3 |
| Distancia de muestra de origen | 35 cm |
| Campo de irradiación (forma, tamaño, geometría) | Campo abierto (sin colimador), cuadrado, 20 x 20 cm |
| Cantidad de dosimetría | Kair y Kwater |
| Método de dosimetría | Como se describe en la sección de protocolo |
| Contenedor de celdas | T25 |
| Cantidad de medios de cultivo celular | 5 ml |
| Velocidad de dosis (Gy/min) | Determinado a continuación |
Tabla 1: Una lista de los parámetros de configuración.
| Atenuador (mm Cu) | Medida ic (nC) | Temperatura (°C) | Presión (hPa) | kT.P | Medida ic corregida por kT.P (nC) | Valor medio corregido (nC) | Desviación st | Estimación de atenuación (M / Mref) | |
| mediciones de referencia (Mref) | 0 | 10.480 | 21.6 | 993.2 | 1.026 | 10.752 | 10.761 | 0.005 | - |
| 10.480 | 21.6 | 993.1 | 1.026 | 10.752 | |||||
| 10.490 | 21.6 | 993.1 | 1.026 | 10.763 | |||||
| 10.490 | 21.6 | 993.1 | 1.026 | 10.763 | |||||
| 10.490 | 21.6 | 993.2 | 1.026 | 10.763 | |||||
| 10.490 | 21.6 | 993.2 | 1.026 | 10.763 | |||||
| 10.490 | 21.6 | 993.1 | 1.026 | 10.763 | |||||
| 10.490 | 21.6 | 993.2 | 1.026 | 10.763 | |||||
| 10.490 | 21.6 | 993.2 | 1.026 | 10.763 | |||||
| 10.490 | 21.6 | 993.1 | 1.026 | 10.763 | |||||
| Hallazgo de espesor de atenuador (M) | 0.514 | 5.840 | 21.7 | 993.2 | 1.026 | 5.992 | - | - | 0.557 |
| 0.564 | 5.651 | 21.7 | 993.2 | 1.026 | 5.798 | - | - | 0.539 | |
| 0.584 | 5.569 | 21.7 | 993.2 | 1.026 | 5.714 | - | - | 0.531 | |
| 0.604 | 5.491 | 21.7 | 993.2 | 1.026 | 5.634 | - | - | 0.524 | |
| 0.615 | 5.441 | 21.7 | 993.2 | 1.026 | 5.582 | - | - | 0.519 | |
| 0.627 | 5.380 | 21.7 | 993.2 | 1.026 | 5.520 | - | - | 0.513 | |
| 0.647 | 5.307 | 21.7 | 993.2 | 1.026 | 5.445 | - | - | 0.506 | |
| 0.667 | 5.240 | 21.8 | 993.2 | 1.026 | 5.376 | - | - | 0.500 | |
| Mediciones con atenuador derecho (M) | 0.667 | 5.231 | 21.8 | 993.4 | 1.026 | 5.368 | 5.373 | 0.003 | 0.499 |
| 0.667 | 5.236 | 21.8 | 993.1 | 1.026 | 5.375 | ||||
| 0.667 | 5.235 | 21.8 | 993.2 | 1.026 | 5.373 | ||||
| 0.667 | 5.236 | 21.8 | 993.2 | 1.026 | 5.374 | ||||
| 0.667 | 5.235 | 21.8 | 993.3 | 1.026 | 5.373 |
Tabla 2: Medición para la determinación de la capa de medio valor.
| Medida ic (nC) | Temperatura (°C) | Presión (hPa) | kT.P | Medida ic corregida por kT.P (nC) | Valor medio corregido por kT.P (nC) | Desviación st | Valor medio corregido por todos los factores de corrección | Velocidad de dosis en bordillo de aire (Gy/min) | Tasa de dosis a nivel celular en Kwater (Gy/min) |
| 2.495 | 22.3 | 1001 | 1.020 | 2.545 | 2.546 | 0.001 | 2.536 | 0.626 | 0.659 |
| 2.496 | 22.3 | 1001 | 1.020 | 2.546 | |||||
| 2.497 | 22.3 | 1001 | 1.020 | 2.547 | |||||
| 2.498 | 22.3 | 1001 | 1.020 | 2.548 | |||||
| 2.496 | 22.3 | 1001 | 1.020 | 2.546 | |||||
| 2.495 | 22.3 | 1000.9 | 1.020 | 2.545 | |||||
| 2.494 | 22.3 | 1000.9 | 1.020 | 2.544 | |||||
| 2.495 | 22.3 | 1000.9 | 1.020 | 2.545 | |||||
| 2.496 | 22.3 | 1000.9 | 1.020 | 2.546 | |||||
| 2.496 | 22.3 | 1000.9 | 1.020 | 2.546 |
Tabla 3: Mediciones diarias de la tasa de dosis para la irradiación celular.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Este trabajo presenta el protocolo utilizado e implementado para las irradiaciones celulares utilizando instalaciones de rayos X de baja energía. Hoy en día, muchos experimentos de radiobiología se realizan con este tipo de irradiador, ya que son fáciles de usar, rentables y con muy pocas restricciones de radioprotección, en comparación con la fuente de cobalto, por ejemplo. Aunque estas configuraciones tienen muchas ventajas, ya que utilizan una fuente de energía de rayos X baja, una modificación de un solo parámetro de irradiación puede afectar significativamente a la dosimetría. Varios estudios ya han destacado la importancia de las normas y protocolos de dosimetría para los estudios de radiobiología2,5,20,21. A pesar de que varios protocolos ya han sido bien definidos en la literatura1,5,decidimos desarrollar un nuevo protocolo para realizar mediciones de dosimetría para simular condiciones reales de irradiación celular tanto como sea posible y tener en cuenta todos los parámetros que pueden influir en la dosis física, especialmente para los rayos X de baja energía21,22. Por lo tanto, hemos optado por implementar un protocolo estricto para minimizar las incertidumbres. Para ello, se establecieron parámetros de irradiación (Tabla 1). A continuación, son necesarios los tres pasos siguientes: i) determinación del índice de calidad del haz, ii) medición de la velocidad de dosis absoluta con una cámara de ionización y iii) medición de la atenuación y dispersión debido al medio de cultivo celular con películas radiocromáticas EBT3.
El índice de calidad del haz correspondía a la pareja de capa de medio valor de voltaje (HVL) utilizada para caracterizar haces de rayos X de baja energía. El HVL es un indicador práctico para describir la radiación poli enérgico y se define como el grosor de un atenuador (generalmente cobre o aluminio) para reducir la tasa de dosis de kerma de aire en un factor de dos del valor original. Las mediciones HVL se realizaron utilizando las siguientes recomendaciones del protocolo AAPM para un haz de rayos X de 40-300 kV10. Sin embargo, había que hacer algunas adaptaciones porque en la carcasa del irradiador no es posible alcanzar una distancia de 1 metro entre la fuente y la cámara de ionización. Por lo tanto, en el trabajo actual, utilizamos una distancia de 58 cm entre la fuente y el detector para las mediciones HVL, como se ilustra en la Figura 1. Decidimos dejar que 25 cm después de la cámara de ionización porque una gran cantidad de material electrónico, soporte, y elementos metálicos están presentes en la parte inferior de la carcasa para limitar el efecto backscatter de estos elementos. La medición del HVL es uno de los aspectos críticos de este protocolo. De hecho, para muchos irradiadores de rayos X, el interior de los recintos está muy restringido y estas no son las condiciones óptimas para realizar las mediciones o se vuelve imposible. Aunque las mediciones experimentales son la mejor manera de evaluar el HVL, cuando estas mediciones son demasiado difíciles o incluso imposibles de realizar, el software dedicado17 se puede utilizar para proporcionar una buena estimación para el HVL, o una simulación de Monte Carlo se puede utilizar23. En el trabajo actual, utilizamos un software dedicado para obtener el espectro de energía de rayos X (Figura 5). También pudimos comparar el HVL medido y calculado, que era el mismo, y también comparar la energía efectiva.
Para mediciones de dosimetría, entonces decidimos simular condiciones reales de irradiación celular tanto como sea posible. Para ello, realizamos directamente las mediciones de velocidad de dosis absoluta con la cámara de ionización dentro del contenedor celular utilizado para la irradiación celular (Figura 3). Sin embargo, como usamos una cámara cilíndrica de ionización calibrada para haces de más de 100 kV, no estábamos exactamente en la misma posición que las células debido al grosor de la cámara de ionización. Para vigas inferiores (15-70 kV), donde se puede utilizar una cámara paralela plana, podemos estar aún más cerca de las condiciones reales de irradiación celular. A continuación, se realizaron mediciones de dosimetría relativas para evaluar la atenuación y la dispersión debido al medio de cultivo celular. Los resultados presentados en este trabajo no destacan una variación significativa en la dosis depositada con o sin la cantidad exacta de medios de cultivo celular, ya que utilizamos una tensión de 220 kV, una filtración adicional de 0,15 mm de Cu y sólo teníamos 5 ml de medio de cultivo celular. Sin embargo, en un estudio anterior21 realizado a 80 kV, señalamos que una variación del medio de cultivo celular y la filtración afecta significativamente la dosis física, hasta un 40% en comparación con la configuración de referencia cuando utilizamos una filtración de aluminio de 1 mm. Este impacto también se demostró en términos de efectos biológicos mediante la medición de la fracción celular sobreviviente utilizando un ensayo clonogénico21,23. Por lo tanto, dependiendo de la tensión, filtración adicional, el contenedor y la cantidad de medios de cultivo celular, la dosis depositada en las células puede ser diferente si el protocolo no se sigue de cerca para todas las irradiaciones.
Por lo tanto, se debe configurar una dosimetría dedicada para todas las configuraciones de irradiación celular. Aunque esto es restrictivo y la modificación de un solo parámetro requiere la implementación de una nueva configuración, hemos decidido tomar esta decisión para estar lo más cerca posible de las condiciones reales de irradiación celular. Esto requiere una estrecha colaboración entre los físicos y el radiobiólogo para configurar el mejor diseño para la configuración. En nuestro instituto, se establecieron una docena de protocolos en nuestra plataforma para un rango de voltaje de 40 a 220 kV para el que se pueden irradiar pozos T25, T75, 6 a 96 platos o placas Petri.
Aunque este protocolo parece bastante largo de implementar, una vez establecida la configuración, la única medida que se tomará el día de la irradiación es la medición de la tasa de dosis con la cámara de ionización dentro del contenedor de la célula. Esta medición es también un control de calidad que nos permite garantizar que la tasa de dosis sea la esperada.
Para garantizar la reproducibilidad de los estudios radiobiológicos, y poder comparar e interpretar experimentos, es importante seguir rigurosamente los protocolos establecidos e informar de todos los aspectos de dosimetría y configuración, especialmente para las instalaciones que utilizan rayos X de baja o media energía. El nuevo protocolo propuesto aquí es para las irradiaciones celulares, aplicables a muchas instalaciones de rayos X, y tiene en cuenta todos los parámetros que influyen en la dosimetría y proporciona una mejor estimación de la dosis real entregada a las células.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
ninguno
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 31010 ionization chamber | PTW | ionization Radiation, Detectors including code of practice, catalog 2019/2020, page 14 | https://www.ptwdosimetry.com/fileadmin/user_upload/DETECTORS_Cat_en_16522900_12/blaetterkatalog/index.html?startpage=1#page_14 |
| EBT3 radiochromic films | Meditest | quote request | https://www.meditest.fr/produit/ebt3-8x10/ |
| electrometer UNIDOSEwebline | PTW | online catalog, quote request | https://www.ptwdosimetry.com/en/products/unidos-webline/?type=3451&downloadfile=1593& cHash= 6096ddc2949f8bafe5d556e931e6c865 |
| HVL material (filter, diaphragm) | PTW | online catalog, page 70, quote request | thickness foils: 0.02, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 5 and 10 mm of copper, https://www.ptwdosimetry.com/fileadmin/user_upload/Online_Catalog/Radiation_Medicine_Cat_en_ 58721100_11/blaetterkatalog/index.html#page_70 |
| scanner for radiochromic films | Epson | quote request | Epson V700, seiko Epson corporation, Suwa, Japan |
| temperature and pressure measurements, Lufft OPUS20 | lufft | quote request | https://www.lufft.com/products/in-room-measurements-291/opus-20-thip-1983/ |
References
- Zoetelief, J., Broerse, J. J., Davies, R. W. Protocol for X-ray dosimetry EULEP. Report No. Report EUR 9507. Commission of the European Communities. , (1985).
- Zoetelief, J., et al. Protocol for X-ray dosimetry in radiobiology. International Journal of Radiation Biology. 77 (7), 817-835 (2001).
- Zoetelief, J., Jansen, J. T. Calculated energy response correction factors for LiF thermoluminescent dosemeters employed in the seventh EULEP dosimetry intercomparison. Physics in Medicine and Biology. 42 (8), 1491-1504 (1997).
- Coleman, C. N., et al. Education and training for radiation scientists: radiation research program and American Society of Therapeutic Radiology and Oncology Workshop, Bethesda, Maryland. Radiation Research. 160 (6), 729-737 (2003).
- Desrosiers, M., et al. The importance of dosimetry standardization in radiobiology. Journal of Research of National Institute of Standards and Technology. 118, 403-418 (2013).
- DIN.
- DIN.
- NCS. Dosimetry of low and medium energy x-rays: A code of practice for use in radiotherapy and radiobiology. NCS. , Report No. 10 (1997).
- International Atomic Energy Agency. Absorbed Dose Determination in External Beam Radiotherapy. International Atomic Energy Agency. , (2000).
- Ma, C. M., et al. AAPM protocol for 40-300 kV x-ray beam dosimetry in radiotherapy and radiobiology. Medical Physics. 28 (6), 868-893 (2001).
- Peixoto, J. G., Andreo, P. Determination of absorbed dose to water in reference conditions for radiotherapy kilovoltage x-rays between 10 and 300 kV: a comparison of the data in the IAEA, IPEMB, DIN and NCS dosimetry protocols. Physics in Medicine and Biology. 45 (3), 563-575 (2000).
- Pedersen, K. H., Kunugi, K. A., Hammer, C. G., Culberson, W. S., DeWerd, L. A. Radiation biology irradiator dose verification survey. Radiation Research. 185 (2), 163-168 (2016).
- Draeger, E., et al. A dose of reality: how 20 years of incomplete physics and dosimetry reporting in radiobiology studies may have contributed to the reproducibility crisis. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 106 (2), 243-252 (2020).
- Devic, S., et al. Precise radiochromic film dosimetry using a flat-bed document scanner. Medical Physics. 32 (7), 2245-2253 (2005).
- Micke, A., Lewis, D. F., Yu, X. Multichannel film dosimetry with nonuniformity correction. Medical Physics. 38 (5), 2523-2534 (2011).
- Filmqa Software. GAF Chromic.com. , Available from: http://www.gafchromic.com/filmqa-software/filmqapro/index.asp (2020).
- Poludniowski, G., Landry, G., DeBlois, F., Evans, P. M., Verhaegen, F. SpekCalc: a program to calculate photon spectra from tungsten anode x-ray tubes. Physics in Medicine and Biology. 54 (19), 433-438 (2009).
- Hubbell, J. H., Seltzer, S. M. X-Ray mass attenuation coefficients - Tables of X-ray mass attenuation coefficients and mass energy-absorption coefficients 1 keV to 20 MeV for elements Z = 1 to 92 and 48 additional substances of dosimetric interest (version 1.4). NIST Standard Reference Database. , 126 (1995).
- Wong, J., et al. High-resolution, small animal radiation research platform with x-ray tomographic guidance capabilities. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 71 (5), 1591-1599 (2008).
- Trompier, F., et al. Investigation of the influence of calibration practices on cytogenetic laboratory performance for dose estimation. International Journal of Radiation Biology. , 1-9 (2016).
- Dos Santos, M., et al. Importance of dosimetry protocol for cell irradiation on a low X-rays facility and consequences for the biological response. International Journal of Radiation Biology. , 1-29 (2018).
- Noblet, C., et al. Underestimation of dose delivery in preclinical irradiation due to scattering conditions. Physica Medica. 30 (1), 63-68 (2014).
- Paixao, L., et al. Monte Carlo derivation of filtered tungsten anode X-ray spectra for dose computation in digital mammography. Radiologia Brasileira. 48 (6), 363-367 (2015).
