Lipidico Injection Protocol for Serial Crystallography Målinger på den australske Synchrotron

Summary

Målet med denne protokollen er å demonstrere hvordan man forbereder seriekrystallografiprøver for datainnsamling på en høy viskøs injektor, Lipidico, nylig bestilt på den australske synchrotron.

Abstract

Et anlegg for å utføre seriekrystallografimålinger er utviklet ved den australske synchrotron. Dette anlegget inneholder en spesialbygd høy viskøs injektor, Lipidico, som en del av den makromolekylære krystallografien (MX2) strålelinjen for å måle et stort antall små krystaller ved romtemperatur. Målet med denne teknikken er å gjøre det mulig for krystaller å bli dyrket/ overført til glasssprøyter som skal brukes direkte i injektoren for seriell krystallografi datainnsamling. Fordelene med denne injektoren inkluderer evnen til å reagere raskt på endringer i strømningshastigheten uten avbrudd i strømmen. Flere begrensninger for denne høyviskositetinjektoren (HVI) finnes som inkluderer en begrensning på de tillatte prøveviskositetene til > 10 Pa.s. Stream stabilitet kan også potensielt være et problem avhengig av de spesifikke egenskapene til utvalget. En detaljert protokoll for hvordan du setter opp prøver og bruker injektoren for seriell krystallografi målinger på den australske synchrotron presenteres her. Metoden demonstrerer fremstilling av prøven, inkludert overføring av lysozymkrystaller til et høyt viskøs medium (silikonfett), og driften av injektoren for datainnsamling ved MX2.

Introduction

Seriekrystallografi (SX) er en teknikk som ble utviklet i utgangspunktet i sammenheng med røntgenfrie elektronlasere (XFELs)^1,2,3,4. Selv om faste måltilnærminger kan brukes til SX^5,6,7, brukes vanligvis injektorsystemer til å levere krystaller i en kontinuerlig strøm til røntgenstrålen. Fordi den kombinerer data fra et stort antall krystaller, unngår SX behovet for krystalljustering under eksperimentet, og gjør det mulig å samle inn data ved romtemperatur^8,9. Ved hjelp av en egnet injektor strømmer krystallene en etter en inn i røntgeninteraksjonsområdet, og de resulterende diffraksjonsdataene samles inn på en^{områdedetektor 9,10}. Hittil har SX vært vellykket i å løse en rekke proteinstrukturer^1,11,12,^{13 inkludert}krystaller for små til å måle ved hjelp av konvensjonell krystallografi. Det har også gitt ny innsikt i tidsløs molekylær dynamikk ved å utnytte femtosekunders pulsvarighet for XFEL. Ved å initiere pumpe-sonde reaksjoner med optiske laserkilder, grundige studier har blitt utført på fotosystem II^14,15, fotoaktivt gult protein^16,17, cytokrom C oksidase¹⁸, samt bakteriorhodopsin^19,20,21. Disse studiene har undersøkt elektronoverføringsdynamikken som oppstår etter lysaktivering som viser det betydelige potensialet for seriekrystallografi for å forstå tidsavklarte biologiske prosesser.

Utvikling av seriekrystallografi blir også stadig mer utbredt ved synchrotron kilder^{9,12,20,22,23,24}. Synchrotron basert SX gjør det mulig for et stort antall individuelle krystaller som skal måles effektivt ved romtemperatur ved hjelp av et passende injektorsystem. Denne tilnærmingen er egnet for mindre krystaller derav, i tillegg til å kreve en rask bildefrekvensdetektor for å samle inn dataene, er det også nødvendig med en mikrofokusert stråle. Sammenlignet med konvensjonell krystallografi, involverer SX ikke montering og justering av individuelle krystaller i røntgenstrålen. Fordi data fra et stort antall individuelle krystaller slås sammen, kan strålingsdosen mottatt av hver krystall reduseres betydelig sammenlignet med konvensjonell krystallografi. Synchrotron SX kan også brukes på studiet av tidsoppsagte reaksjoner, selv ned til millisekundregimet, forutsatt at en detektor med tilstrekkelig høy bildefrekvens er tilgjengelig (f.eks. 100 Hz eller mer). Flere seriell krystallografi eksperimenter har blitt utført på synchrotron ved hjelp av injektorer som opprinnelig ble utviklet på XFEL^{kilder 20,22,23}. De to vanligste typene injektor er gass dynamisk virtuell dyse (GDVN)²⁵ og høy viskøs injektor (HVI)^{9,24,26,27,28}. GDVN er ideell for å injisere lav viskositet, flytende prøver, men krever høye strømningshastigheter for å oppnå stabile bekker, noe som igjen fører til høye utvalgsforbruksrater. HVI-er er derimot egnet for høyviskositetsprøver som gjør det mulig å lage en stabil strøm ved mye lavere strømningshastigheter, noe som fører til mye lavere utvalgsforbruk. HVI-injektoren favoriserer derfor levering av prøver der en viskøs transportør er å foretrekke (f.eks. lipidbasert for membranproteiner) og/eller store mengder prøve er ikke tilgjengelige. SX injektorer er generelt utfordrende å bruke og krever omfattende opplæring for å operere. De involverer også lange prøveoverføringsprotokoller, da prøven må lastes inn i et spesialisert reservoar, dette har generelt en høy risiko forbundet med at prøven går tapt enten i “dødt volum” eller via lekkasjer i forbindelsene. Derfor er det ønskelig å optimalisere injektordesignen for å redusere eventuelle tap før prøven når røntgenstrålen.

Nylig ble de første SX-resultatene publisert ved hjelp av Lipidico^{23 med} et lysozymmål, ved hjelp av en Eiger 16M detektor. Denne injektordesignen begrenser prøvesvinn ved å minimere antall skritt involvert i å gå fra første krystallisering til overføring av krystaller til injektoren etterfulgt av levering av prøve til røntgenstrålen. Dette manuskriptet beskriver og demonstrerer prøveoverføringsprosedyren fra prøveforberedelse, går videre til injeksjonsprosessen, og til slutt datainnsamling, ved hjelp av samme krystalliseringsfartøy. Injektorens drift er også beskrevet.

Protocol

1. Fremstilling av krystaller i et høyt viskøs medium ved hjelp av glasssprøyter Sentrifuger krystalloppløsningen forsiktig (~ 1000 x g, ~ 10 min ved 22 ° C) for å danne en myk krystallpellet og fjerne overflødig buffer. Dette vil resultere i en høy konsentrasjon av krystaller i pellet som kan brukes til datainnsamling.MERK: For å forhindre fortynning av det viskøse mediet øker krystallkonsentrasjonen på dette trinnet. Optimaliser forholdet mellom viskøs media og krystallvolum for hver…

Representative Results

Lipidico er et HVI bygget som et alternativt leveringssystem for bruk på MX2 (figur 1). Den er ideell for SX hvor krystaller enten dyrkes i lipidisk kubikkfase eller overføres til et høyt viskøs inert media. For å demonstrere injektoren påføring silikon fett blandet med lysozyme krystaller ble brukt til å samle SX data på MX2 strålelinje på den australske synchrotron. For å montere injektoren på MX2-strålesnoren fjernes kryogendysen og erstattes av i…

Discussion

En alternativ HVI er utviklet, ideell for å utføre SX-eksperimenter ved synchrotron kilder. Den har to viktige fordeler fremfor eksisterende HVIer. For det første er det enkelt å installere på strålelinjen slik at rask veksling mellom konvensjonell krystallografi og SX, bare ~ 30 minutter er nødvendig for installasjon og justering på MX2. For det andre kan prøvesprøytene som brukes til å dyrke krystaller, brukes direkte som reservoarer for injeksjon, noe som begrenser svelhet under prøveoverføring. Protokoll…

Materials

Hen eggwhite lysozyme	Sigma-Aldrich	L6876	Used to grow crystals for testing the injector and the crystals are transferred into silicon grease. https://www.sigmaaldrich.com/
High vacuum silicon grease	Dow Corning	Z273554-1EA	Used for testing of injector. https://www.sigmaaldrich.com/
Injector needle (108 µm ID)	Hamilton	part No: 7803-05	www.hamiltoncompany.com
Glass gas-tight syringes, 100 µl	Hamilton	part no: 7656-01	Syringes used for sample injection. www.hamiltoncompany.com
LCP syringe coupler	Formulatrix	209526	Syringe coupler to mix the samples
Lipidico injector	La Trobe Univerity/ANSTO		This is a specific piece of equipment that can be accessed through La Trobe University / ANSTO Australian Synchrotron Facility