Protocole d’injection lipidique pour les mesures de cristallographie en série au synchrotron australien
Summary
L’objectif de ce protocole est de démontrer comment préparer des échantillons de cristallographie en série pour la collecte de données sur un injecteur visqueux élevé, Lipidico, récemment commandé au synchrotron australien.
Abstract
Une installation pour effectuer des mesures de cristallographie en série a été développée au synchrotron australien. Cette installation intègre un injecteur visqueux élevé construit à cet effet, Lipidico, dans le cadre de la cristallographie macromoléculaire (MX2) beamline pour mesurer un grand nombre de petits cristaux à température ambiante. L’objectif de cette technique est de permettre aux cristaux d’être cultivés/transférés dans des seringues en verre pour être utilisés directement dans l’injecteur pour la collecte de données de cristallographie en série. Les avantages de cet injecteur comprennent la capacité de réagir rapidement aux changements dans le débit sans interruption du flux. Plusieurs limitations pour cet injecteur de viscosité élevée (HVI) existent qui incluent une restriction sur les viscosités autorisées d’échantillon à >10 Pa.s. La stabilité du flux peut également être un problème en fonction des propriétés spécifiques de l’échantillon. Un protocole détaillé sur la façon de mettre en place des échantillons et d’utiliser l’injecteur pour les mesures de cristallographie en série au synchrotron australien est présenté ici. La méthode démontre la préparation de l’échantillon, y compris le transfert de cristaux de lysozyme dans un média visqueux élevé (graisse de silicone), et le fonctionnement de l’injecteur pour la collecte de données à MX2.
Introduction
La cristallographie en série (SX) est une technique qui a été développée initialement dans le contexte des lasers à électrons libres à rayons X (XFELs)1,2,3,4. Bien que les approches à cibles fixes puissent être utilisées pour SX5,6,7, généralement, les systèmes d’injection sont utilisés pour livrer des cristaux dans un flux continu au faisceau de rayons X. Parce qu’il combine les données d’un grand nombre de cristaux, SX évite la nécessité d’un alignement de cristal pendant l’expérience, et permet de recueillir des données à températureambiante 8,9. À l’aide d’un injecteur approprié, les cristaux sont diffusés un par un dans la zone d’interaction aux rayons X et les données de diffraction qui en résultent sont recueillies sur un détecteur dezone 9,10. À ce jour, SX a réussi à résoudre un certain nombre de structures protéiques1,11,12,13, y compris les cristaux trop petits pour être mesurer à l’aide de la cristallographie conventionnelle. Il a également fourni de nouvelles perspectives sur la dynamique moléculaire résolue dans le temps en exploitant la durée de l’impulsion femtoseconde du XFEL. En lançant des réactions pompe-sonde avec des sources laser optiques, des études approfondies ont été menées sur le photosystème II14,15, protéine jaune photoactive16,17, cytochrome C oxidase18, ainsi que la bactériorhodopsine19,20,21. Ces études ont sondé la dynamique de transfert d’électrons qui se produit après l’activation de la lumière démontrant le potentiel significatif de la cristallographie en série pour comprendre les processus biologiques résolus dans le temps.
Le développement de la cristallographie en série est également de plus en plus répandu aux sources synchrotron9,12,20,22,23,24. Le SX à base de synchrotron permet de mesurer efficacement un grand nombre de cristaux individuels à température ambiante à l’aide d’un système d’injection approprié. Cette approche convient aux cristaux plus petits, donc, en plus d’exiger un détecteur rapide de taux d’image pour recueillir les données, un faisceau micro-focalisé est également nécessaire. Par rapport à la cristallographie conventionnelle, SX n’implique pas le montage et l’alignement des cristaux individuels dans le faisceau de rayons X. Étant donné que les données d’un grand nombre de cristaux individuels sont fusionnées, la dose de rayonnement reçue par chaque cristal peut être considérablement réduite par rapport à la cristallographie conventionnelle. Synchrotron SX peut également être appliqué à l’étude des réactions résolues dans le temps, même jusqu’au régime milliseconde, à condition qu’un détecteur avec un taux d’image suffisamment élevé est disponible (par exemple, 100 Hz ou plus). Plusieurs expériences de cristallographie en série ont été réalisées au synchrotron à l’aide d’injecteurs initialement développés aux sources XFEL20,22,23. Les deux types les plus communs d’injecteur sont la buse virtuelle dynamique de gaz (GDVN)25 et l’injecteur visqueux élevé (HVI)9,24,26,27,28. Le GDVN est idéal pour injecter de faibles viscosités, des échantillons liquides, mais nécessite des débits élevés pour atteindre des débits stables, ce qui conduit à des taux élevés de consommation d’échantillons. En revanche, les HVI conviennent aux échantillons de viscosité élevée qui permettent la production d’un flux stable à des débits beaucoup plus faibles, ce qui entraîne une consommation d’échantillons beaucoup plus faible. L’injecteur HVI favorise donc la livraison d’échantillons lorsqu’un porteur visqueux est préférable (p. ex., à base de lipides pour les protéines membranaires) et/ou que de grandes quantités d’échantillons ne sont pas disponibles. Les injecteurs SX sont généralement difficiles à utiliser et nécessitent une formation approfondie pour fonctionner. Il s’agit également de protocoles de transfert d’échantillons longs, car l’échantillon doit être chargé dans un réservoir spécialisé, ce qui comporte généralement un risque élevé associé à la perte d’échantillons dans le « volume mort » ou par des fuites dans les connexions. Par conséquent, il est souhaitable d’optimiser la conception de l’injecteur pour atténuer les pertes avant que l’échantillon n’atteigne le faisceau de rayons X.
Récemment, les premiers résultats SX ont été publiés à l’aide de Lipidico23 avec une cible lysozyme, à l’aide d’un détecteur Eiger 16M. Cette conception d’injecteur limite le gaspillage de l’échantillon en minimisant le nombre d’étapes impliquées dans le fait de passer de la cristallisation initiale au transfert de cristaux dans l’injecteur, suivi de la livraison de l’échantillon au faisceau de rayons X. Ce manuscrit décrit et démontre la procédure de transfert de l’échantillon à partir de la préparation de l’échantillon, du passage au processus d’injection, et enfin de la collecte de données, à l’aide du même récipient de cristallisation. Le fonctionnement de l’injecteur est également décrit.
Protocol
Representative Results
Discussion
Une alternative HVI a été développée, idéale pour effectuer des expériences SX à des sources synchrotron. Il présente deux avantages clés par rapport aux IDH existants. Tout d’abord, il est facile à installer sur la ligne de faisceau permettant une commutation rapide entre la cristallographie conventionnelle et SX, seulement ~ 30 minutes est nécessaire pour l’installation et l’alignement sur MX2. Deuxièmement, les seringues d’échantillon utilisées pour faire pousser des cristaux peuvent être direct…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux ont été appuyés par l’Australian Research Council Centre of Excellence in Advanced Molecular Imaging (CE140100011) (http://www.imagingcoe.org/). Cette recherche a été entreprise en partie à l’aide de la ligne de faisceau MX2 au synchrotron australien, qui fait partie de l’ANSTO, et a fait usage du détecteur de l’Australian Cancer Research Foundation (ACRF).
Materials
| Hen eggwhite lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | Used to grow crystals for testing the injector and the crystals are transferred into silicon grease. https://www.sigmaaldrich.com/ |
| High vacuum silicon grease | Dow Corning | Z273554-1EA | Used for testing of injector. https://www.sigmaaldrich.com/ |
| Injector needle (108 µm ID) | Hamilton | part No: 7803-05 | www.hamiltoncompany.com |
| Glass gas-tight syringes, 100 µl | Hamilton | part no: 7656-01 | Syringes used for sample injection. www.hamiltoncompany.com |
| LCP syringe coupler | Formulatrix | 209526 | Syringe coupler to mix the samples |
| Lipidico injector | La Trobe Univerity/ANSTO | This is a specific piece of equipment that can be accessed through La Trobe University / ANSTO Australian Synchrotron Facility |
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