Protocolo de injeção de lipidico para medições de cristalografia serial no Síncrotron Australiano
Summary
O objetivo deste protocolo é demonstrar como preparar amostras de cristalografia serial para coleta de dados em um injetor viscoso alto, Lipidico, recentemente encomendado no síncrotron australiano.
Abstract
Uma instalação para a realização de medições de cristalografia serial foi desenvolvida no síncrotron australiano. Esta instalação incorpora um injetor viscoso de alto efeito construído, Lipidico, como parte da linha de cristalografia macromolecular (MX2) para medir um grande número de pequenos cristais à temperatura ambiente. O objetivo desta técnica é permitir que cristais sejam cultivados/transferidos para seringas de vidro para serem usados diretamente no injetor para coleta de dados de cristalografia serial. As vantagens deste injetor incluem a capacidade de responder rapidamente às mudanças na taxa de fluxo sem interrupção do fluxo. Existem várias limitações para este injetor de alta viscosidade (HVI) que incluem uma restrição sobre as viscosidades amostrais permitidas para >10 Pa.s. A estabilidade do fluxo também pode ser um problema potencialmente dependendo das propriedades específicas da amostra. Um protocolo detalhado de como configurar amostras e operar o injetor para medições de cristalografia serial no síncrotron australiano é apresentado aqui. O método demonstra a preparação da amostra, incluindo a transferência de cristais de lise em uma alta mídia viscosa (graxa de silicone), e o funcionamento do injetor para coleta de dados em MX2.
Introduction
A cristalografia serial (SX) é uma técnica que foi desenvolvida inicialmente no contexto de Lasers eletrônicos livres de raios-X (XFELs)1,2,3,4. Embora abordagens de alvo fixas possam ser usadas para SX5,6,7, normalmente, sistemas injetores são empregados para fornecer cristais em um fluxo contínuo para o feixe de raios-X. Por combinar dados de um grande número de cristais, o SX evita a necessidade de qualquer alinhamento de cristal durante o experimento, e permite que os dados sejam coletados à temperatura ambiente8,9. Com o auxílio de um injetor adequado, os cristais são transmitidos um a um na área de interação com raios-X e os dados de difração resultantes são coletados em um detector de área9,10. Até o momento, a SX foi bem sucedida na resolução de uma série de estruturas proteicas1,11,12,13 incluindocristais muito pequenos para medir usando a cristalografia convencional. Ele também forneceu novas percepções sobre a dinâmica molecular resolvida pelo tempo explorando a duração do pulso femtosegundo do XFEL. Iniciando reações de bomba-sonda com fontes ópticas de laser, estudos aprofundados foram realizados no fotossistema II14,15, proteína amarela fotoativa16,17, citocromo C oxidase18, bem como bacteriorhodopsin19,20,21. Esses estudos sondaram a dinâmica de transferência de elétrons que ocorrem após a ativação da luz demonstrando o potencial significativo da cristalografia serial para a compreensão de processos biológicos resolvidos pelo tempo.
O desenvolvimento da cristalografia serial também está se tornando cada vez mais prevalente nas fontes síncrotrons9,12,20,22,23,24. O SX baseado em síncrotron permite que um grande número de cristais individuais seja medido eficientemente à temperatura ambiente usando um sistema injetor apropriado. Essa abordagem é adequada para cristais menores, portanto, além de exigir um detector rápido de taxa de quadros para coletar os dados, um feixe micro-focado também é necessário. Em comparação com a cristalografia convencional, o SX não envolve a montagem e alinhamento de cristais individuais no feixe de raios-X. Como os dados de um grande número de cristais individuais são mesclados, a dose de radiação recebida por cada cristal pode ser substancialmente reduzida em comparação com a cristalografia convencional. O SX síncrotron também pode ser aplicado ao estudo de reações resolvidas pelo tempo, mesmo até o regime de milissegundos, desde que um detector com uma taxa de quadro suficientemente alta esteja disponível (por exemplo, 100 Hz ou mais). Vários experimentos de cristalografia serial foram realizados no síncrotron usando injetores que foram inicialmente desenvolvidos nas fontes XFEL20,22,23. Os dois tipos mais comuns de injetor são o Bocal Virtual Gas Dynamic (GDVN)25 e o Injetor Viscoso Alto (HVI)9,24,26,27,28. O GDVN é ideal para injetar baixa viscosidade, amostras líquidas, mas requer altas taxas de fluxo para alcançar fluxos estáveis, o que por sua vez leva a altas taxas de consumo amostral. Em contrapartida, os HVI’s são adequados para amostras de alta viscosidade que permitem a geração de um fluxo estável a taxas de fluxo muito mais baixas, levando a um consumo amostral muito menor. O injetor HVI, portanto, favorece a entrega de amostras onde um portador viscoso é preferível (por exemplo, à base de lipídios para proteínas de membrana) e/ou grandes quantidades de amostra não estão disponíveis. Os injetores SX são geralmente desafiadores de usar e requerem treinamento extensivo para operar. Eles também envolvem protocolos longos de transferência de amostras, uma vez que a amostra precisa ser carregada em um reservatório especializado, isso geralmente tem um alto risco associado a ela de a amostra ser perdida no ‘volume morto’ ou através de vazamentos nas conexões. Portanto, é desejável otimizar o design do injetor para mitigar quaisquer perdas antes da amostra atingir o feixe de raios-X.
Recentemente, os primeiros resultados do SX foram publicados usando Lipidico23 com um alvo lysozyme, usando um detector Eiger 16M. Este projeto do injetor limita o desperdício da amostra, minimizando o número de etapas envolvidas na ida da cristalização inicial à transferência de cristais no injetor seguido pela entrega da amostra para o feixe de raios-X. Este manuscrito descreve e demonstra o procedimento de transferência de amostras a partir da preparação da amostra, passando para o processo de injeção e, finalmente, coleta de dados, usando o mesmo vaso de cristalização. O funcionamento do injetor também é descrito.
Protocol
Representative Results
Discussion
Um HVI alternativo foi desenvolvido, ideal para a realização de experimentos SX em fontes síncrotrons. Ele tem duas vantagens fundamentais sobre os HVIs existentes. Primeiro, é fácil instalar na linha de trave permitindo uma comutação rápida entre cristalografia convencional e SX, apenas ~30 minutos é necessário para instalação e alinhamento no MX2. Em segundo lugar, as seringas amostrais usadas para cultivar cristais podem ser usadas diretamente como reservatórios para injeção, limitando o desperdício du…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo Australian Research Council Centre of Excellence in Advanced Molecular Imaging (CE140100011) (http://www.imagingcoe.org/). Esta pesquisa foi realizada em parte usando a linha de feixe MX2 no Síncrotron Australiano, parte do ANSTO, e fez uso do detector da Australian Cancer Research Foundation (ACRF).
Materials
| Hen eggwhite lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | Used to grow crystals for testing the injector and the crystals are transferred into silicon grease. https://www.sigmaaldrich.com/ |
| High vacuum silicon grease | Dow Corning | Z273554-1EA | Used for testing of injector. https://www.sigmaaldrich.com/ |
| Injector needle (108 µm ID) | Hamilton | part No: 7803-05 | www.hamiltoncompany.com |
| Glass gas-tight syringes, 100 µl | Hamilton | part no: 7656-01 | Syringes used for sample injection. www.hamiltoncompany.com |
| LCP syringe coupler | Formulatrix | 209526 | Syringe coupler to mix the samples |
| Lipidico injector | La Trobe Univerity/ANSTO | This is a specific piece of equipment that can be accessed through La Trobe University / ANSTO Australian Synchrotron Facility |
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