Kwantificeren van de Brain Gemetastatische Tumor Micro-Environment met behulp van een Organ-On-A Chip 3D Model, Machine Learning en Confocal Tomography
Summary
Hier presenteren we een protocol voor het voorbereiden en kweken van een bloed-hersenbarrière gemetastaseerde tumor micro-omgeving en vervolgens kwantificeren van de toestand met behulp van confocale beeldvorming en kunstmatige intelligentie (machine learning).
Abstract
Hersenmetastasen zijn de meest dodelijke kankerletsels; 10-30% van alle kankers metastaseren naar de hersenen, met een mediane overleving van slechts ~ 5-20 maanden, afhankelijk van het type kanker. Om de hersenstastatische tumorlast te verminderen, moeten hiaten in basis- en translationele kennis worden aangepakt. Grote uitdagingen zijn een gebrek aan reproduceerbare preklinische modellen en bijbehorende instrumenten. Driedimensionale modellen van metastase van de hersenen kunnen de relevante moleculaire en fenotypische gegevens opleveren die worden gebruikt om aan deze behoeften te voldoen in combinatie met speciale analysetools. Bovendien, in vergelijking met murine modellen, orgaan-op-een-chip modellen van patiënt tumorcellen dwars door de bloed-hersenbarrière in de hersenen micro-omgeving genereren snel resultaten en zijn meer interpreteerbaar met kwantitatieve methoden, dus vatbaar voor een hoge doorvoer testen. Hier beschrijven en demonstreren we het gebruik van een nieuw 3D-microfluïde bloedhersenniche (μmBBN) platform waar meerdere elementen van de niche gedurende een langere periode (enkele dagen) kunnen worden gekweekt, fluorescerend worden afgebeeld door confocale microscopie, en de beelden gereconstrueerd met behulp van een innovatieve confocale tomografietechniek; alle gericht op de ontwikkeling van micro-metastase en veranderingen in de tumor micro-omgeving (TME) te begrijpen in een herhaalbare en kwantitatieve manier. We laten zien hoe je de kankercellen en TME cellulaire en humorale componenten fabriceren, zaaien, beeld, en analyseren, met behulp van dit platform. Bovendien laten we zien hoe kunstmatige intelligentie (AI) wordt gebruikt om de intrinsieke fenotypische verschillen van kankercellen te identificeren die door een model μmBBN kunnen worden doorgevoerd en om ze een objectieve index van hersenuitzaaiend potentieel toe te wijzen. De gegevenssets die door deze methode worden gegenereerd, kunnen worden gebruikt om fundamentele en translationele vragen over metastase, de werkzaamheid van therapeutische strategieën en de rol van de TME in beide te beantwoorden.
Introduction
Hersenmetastasen zijn de meest dodelijke kankerletsels; 10-30% van alle kankers metastaseren naar de hersenen, met een mediane overleving van slechts ~ 5-20 maanden, afhankelijk van het type kanker1,,2. Een belangrijke vraag die ontstaat bij het bestuderen van kankermetastase is hoe subklonen migreren van de humorale omgeving van de bloedbaan in een orgaan zoals de hersenen3,4. Deze vraag heeft geleid tot vele variaties van migratie, invasie, en extravasation testen. Al deze methoden delen de kritieke stap van het tellen of meten van eigenschappen van cellen die van de ene locatie naar de andere gaan in reactie op een stimulus. De meeste migratietesten die direct beschikbaar zijn, worden gebruikt om tweedimensionale (2D) migratie van kankercellen te bestuderen. Deze hebben een schat aan kennis opgehelderd; zij vatten echter niet het driedimensionale karakter samen van het in vivo-systeem dat andere methoden kunnen leveren5. Daarom is het noodzakelijk om de tumormicro-omgeving (TME) te bestuderen in driedimensionale (3D)-systemen, maar de analysebenaderingen die beschikbaar zijn voor 3D-structuren zijn beperkt en vaak inconsistent.
Een van de meest populaire 3D-tools is een Boyden kamer die bestaat uit een membraan opgehangen aan de onderkant van een put, het scheiden van twee verschillende regio’s. Boyden introduceerde de test om leukocyte chemotaxis4te bestuderen. De onderste gebieden kunnen worden gevarieerd door chemie of andere middelen6,7 om cellen in het bovenste gebied te induceren om te migreren naar het lagere gebied. De meest voorkomende benadering voor het kwantificeren van het aantal cellen dat is gemigreerd is om de cellen vrij te geven van de bodem van het membraan met behulp van een buffer oplossing, lyse ze, en vervolgens tellen ze op basis van de hoeveelheid DNA-inhoud in de oplossing7. Deze indirecte benadering is gevoelig voor fouten van de operator als gevolg van techniek variabiliteit en de procedure vernietigt informatie over het kankerfenotype en de micro-omgeving. Variaties van de Boyden kamertest omvatten fixatie van trekkende cellen die op het membraan blijven, maar alleen een aantal cellen biedt die niet langer levensvatbaar zijn voor voortgezet onderzoek6,8,9.
Als gevolg van beperkingen van de Boyden kamer en de groei van innovaties in de microfluïde gemeenschap, migratie test chips zijn ontwikkeld die de beweging van cellen in reactie op een stimulus in een richting in plaats van drie10,11,12observeren . Deze migratietesten vergemakkelijken de controle over factoren zoals stroom of eencellige scheiding13,14 die een betere interpretatie van de resultaten mogelijk maken; echter, hun 2D-formaat onvermijdelijk verliest wat dynamische informatie. Recente studies hebben zich gericht op extravasatie (d.w.z. de beweging van cellen uit het verkeer naar een weefsel, zoals de bloedhersenbarrière) in een 3D-omgeving14,15. De extravasatie afstand in weefsel en indringend gedrag dat optreedt bij de cellulaire barrière / membraan is verfijnder dan metingen opgedaan met behulp van ofwel de Boyden kamer of een 2D microfluïde migratie apparaat16. Zo zijn apparaten die de juiste beeldvorming en analyse van 3D-extravasatie mogelijk maken van cruciaal belang om deze geavanceerde metingen vast te leggen, maar ontbreken ze in de literatuur.
Onafhankelijk van migratietesten zijn robuuste beeldvormingstechnieken ontwikkeld voor magnetic resonance imaging (MRI) en tomografie die weefsel in 3D-ruimte17,18nauwkeurig kunnen identificeren en nauwkeurig reconstrueren. Deze technieken verwerven beelden in z-stacks en segmentgedeelten van het beeld op basis van de eigenschappen van het weefsel en zetten vervolgens de gesegmenteerde afbeeldingen om in driedimensionale mazen19,20,21. Dit stelt artsen in staat om te visualiseren in 3D individuele organen, botten en bloedvaten om te helpen bij chirurgische planning of hulp bij de diagnose van kanker of hart-en vaatziekten22,23. Hier zullen we laten zien dat deze benaderingen kunnen worden aangepast voor gebruik op microscopische exemplaren en 3D-extravasatie-apparaten.
Hiertoe ontwikkelden we de innovatieve confocale tomografietechniek, die hierin wordt gepresenteerd, die flexibiliteit biedt om de extravasatie van tumorcellen over een membraan te bestuderen door bestaande tomografietools aan te passen. Deze aanpak maakt het mogelijk om het volledige gamma van kankercelgedrag te bestuderen terwijl ze interageren met een cellulaire barrière, zoals een endotheelcellaag. Kankercellen vertonen indringend gedrag; sommigen kunnen binnenvallen, maar blijven dicht bij het membraan, terwijl anderen gemakkelijk door de barrière gaan. Deze techniek kan informatie opleveren over het fenotype van de cel in alle dimensies24. Met behulp van deze aanpak om de TME te bestuderen is zowel relatief goedkoop, gemakkelijk te interpreteren, en reproduceerbaar, in vergelijking met meer complexe in vivo murine modellen. De gepresenteerde methodologie moet een sterke basis bieden voor de studie van vele soorten tumoren en micro-omgevingen door de stromale regio aan te passen.
We beschrijven en demonstreren het gebruik van een 3D microfluïde bloedhersenniche (μmBBN) platform (Figuur 1) waar kritische elementen van de barrière en niche (microvasculaire endotheliale cellen en astrocyten) gedurende een langere periode (ongeveer tot 9 dagen) kunnen worden gekweekt, fluorescerend afgebeeld door confocale microscopie, en de beelden gereconstrueerd met behulp van onze confocale tomografietechniek (figuur 2); alle gericht op de ontwikkeling van micro-metastase en veranderingen in de tumor micro-omgeving te begrijpen in een herhaalbare en kwantitatieve manier. De bloed-hersenbarrière interface met de hersenen niche is samengesteld uit de hersenen microvasculaire endotheelcellen die worden versterkt door kelder membraan, astrocyten voeten, en pericyten25. We hebben ons selectief gericht op de astrocyten en endotheelcomponenten gezien hun belang in de vorming en regulatie van de bloedhersenbarrière. We laten zien hoe je de kankercellen en tumormicro-omgevingscomponenten en humorale componenten fabriceren, zaaien, beeld, en analyseren, met behulp van dit platform. Ten slotte laten we zien hoe machine learning kan worden gebruikt om de intrinsieke fenotypische verschillen van kankercellen te identificeren die in staat zijn om door een model μmBBN te worden doorgevoerd en om ze een objectieve index van hersenuitzaaiend potentieel toe te wijzen24. De gegevenssets die door deze methode worden gegenereerd, kunnen worden gebruikt om fundamentele en translationele vragen over metastase, therapeutische strategieën en de rol van de TME in beide te beantwoorden.
Protocol
Representative Results
Discussion
We hebben een nieuwe methode ontwikkeld en gepresenteerd die tools aanpast die vaak worden gebruikt in klinische beeldanalyses voor het meten van extravasatie en migratie van kankercellen via een endotheelbarrière in hersenweefsel. We stellen dat deze aanpak nuttig kan zijn voor zowel in vivo als in vitro metingen; we hebben aangetoond dat het gebruik ervan op een 3D-microfluïdisch systeem recapituleren hersenen vasculatuur. Kankercelmetingen inclusief extradatieafstand, percentage extravasated door volume, sfericiteit…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken het Steeg Lab, bij het Nationaal Kankerinstituut voor de gulle donatie van MDA-MB-231-BR-GFP cellen. Confocale microscopie werd uitgevoerd aan de Universiteit van Michigan Biointerfaces Institute (BI). Flow cytometrie werd uitgevoerd aan de Universiteit van Michigan Flow Cytometry Core. Virale vectoren zijn gemaakt door de Universiteit van Michigan Vector Core. We danken Kelley Kidwell ook voor de begeleiding bij de statistische analyse van deze gegevens.
Financiering:
C.R.O. werd gedeeltelijk ondersteund door een NIH T-32 Training Fellowship (T32CA009676) en 1R21CA245597-01. T.M.W. werd gedeeltelijk ondersteund door 1R21CA245597-01 en het National Center for Advancing Translational Sciences van de National Institutes of Health onder Award Number UL1TR002240. Financiering voor materialen en karakterisering werd verstrekt door National Cancer Institute of the National Institutes of Health onder award nummer 1R21CA245597-01, P30CA046592, 5T32CA009676-23, CA196018, AI116482, METAvivor Foundation, en de Breast Cancer Research Foundation. De inhoud valt uitsluitend onder de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële opvattingen van de National Institutes of Health
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA with phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| 1.5 mm biopsy punch with plunger | Integra LifeSciences Corporation | 33-31A-P/25 | |
| 10x MEM | Thermo Fisher Scientific | 11430030 | |
| 150 mm petri dishes | Fisher Scientific | FB0875714 | |
| 1x DPBS, without Ca and Mg | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
| 200uL pipette tip | Fisher Scientific | 02-707-411 | |
| 4 inch silicon wafer | University Wafer | 452 | |
| 48 mm wide packing tape | Fisher Scientific | 19-072-097 | |
| 50 x 75 mm glass slide | Fisher Scientific | 12-550C | |
| A1 confocal microscope | Nikon | ||
| acetone | Fisher Scientific | A9-20 | |
| antibiotic/antimycotic (penicillin/streptomycin/amphotericin) | Gibco | 15240062 | |
| box cutter blade | Fisher Scientific | NC1721575 | |
| dissection scissors | Fisher Scientific | 08-951-5 | |
| DMEM with 4.5 g/L glucose | Thermo Fisher Scientific | 11960-044 | |
| double sided tape | Fisher Scientific | NC0879005 | |
| EGM-2 | Lonza | CC-3162 | |
| Fetal Bovine Serum, Heat inactivated | Corning | MT35011CV | |
| Fiji software | ImageJ | ||
| glass vial | Fisher Scientific | 03-341-25D | |
| glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| hCMEC/D3 | EMD Millipore | SCC066 | |
| Jupyter notebook | Anaconda | ||
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| Matrigel – growth factor reduced with phenol red | Corning | CB-40230A | |
| MDA-MB-231 | ATCC | HTB-26 | |
| MDA-MB-231-BR-GFP | Dr. Patricia Steeg, NIH | ||
| N-2 growth supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| normal human astrocytes (NHA) | Lonza | CC-2565 | |
| Orange software | University of Ljubljana | ||
| Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-711-9AM | |
| Photolithography masks | Photosciences Incorporated | ||
| pLL3.7-dsRed | University of Michigan Vector Core | ||
| pLL-EV-GFP | University of Michigan Vector Core | ||
| pLOX-TERT-iresTK | Addgene | 12245 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| polycarbonate membrane, 5um pore size | Millipore | TMTP04700 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| PureCol, 3 mg/mL | Advanced Biomatrix | 5005 | Type I bovine collagen |
| sodium bicarbonate | Thermo Fisher Scientific | 25080094 | |
| sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | |
| Solo cup | Fisher Scientific | NC1416545 | |
| SU-8 2075 | MicroChem Corporation | Y111074 0500L1GL | |
| SU8 developer | MicroChem Corporation | Y020100 4000L1PE | |
| Sylgard 184 | Ellsworth Adhesive Company | NC0162601 | |
| Toluene | Sigma-Aldrich | 179965-1L | |
| Tricholoro perfluoro octyl silane | Sigma-Aldrich | 448931-10G |
References
- Rastogi, K., et al. Palliation of Brain Metastases: Analysis of Prognostic Factors Affecting Overall Survival. Indian Journal of Palliative Care. 24 (3), 308-312 (2018).
- Wang, R., et al. The Clinicopathological features and survival outcomes of patients with different metastatic sites in stage IV breast cancer. BMC Cancer. 19 (1), 1091 (2019).
- Valster, A., et al. Cell migration and invasion assays. Methods. 37 (2), 208-215 (2005).
- Eccles, S. A., Box, C., Court, W. Cell migration/invasion assays and their application in cancer drug discovery. Biotechnology Annual Review. 11, 391-421 (2005).
- Brekhman, V., Neufeld, G. A novel asymmetric 3D in-vitro assay for the study of tumor cell invasion. BMC Cancer. 9, 415 (2009).
- Chen, H. C. Boyden chamber assay. Methods in Molecular Biology. 294, 15-22 (2005).
- Poissonnier, A., Legembre, P. Boyden Chamber Assay to Study of Cell Migration Induced by Metalloprotease Cleaved-CD95L. Methods in Molecular Biology. 1557, 117-123 (2017).
- Li, X., Yang, H., Huang, H., Zhu, T. CELLCOUNTER: novel open-source software for counting cell migration and invasion in vitro. BioMed Research International. 2014, 863564 (2014).
- Little, A. C., et al. IL-4/IL-13 Stimulated Macrophages Enhance Breast Cancer Invasion Via Rho-GTPase Regulation of Synergistic VEGF/CCL-18 Signaling. Frontiers in Oncology. 9, 456 (2019).
- Allen, S. G., et al. Macrophages Enhance Migration in Inflammatory Breast Cancer Cells via RhoC GTPase Signaling. Scientific Reports. 6, 39190 (2016).
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Chen, Y. C., et al. Single-cell Migration Chip for Chemotaxis-based Microfluidic Selection of Heterogeneous Cell Populations. Scientific Reports. 5, 9980 (2015).
- Choi, Y. P., et al. Cancer-associated fibroblast promote transmigration through endothelial brain cells in three-dimensional in vitro models. International Journal of Cancer. 135 (9), 2024-2033 (2014).
- Takeshita, Y., et al. An in vitro blood-brain barrier model combining shear stress and endothelial cell/astrocyte co-culture. Journal of Neuroscience Methods. 232, 165-172 (2014).
- Kienast, Y., et al. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nature Medicine. 16 (1), 116-122 (2010).
- Schroeder, W., Martin, K., Lorenson, B. . The Visualization Toolkit. 4th edn. , (2006).
- Wells, W. M., Grimson, W. L., Kikinis, R., Jolesz, F. A. Adaptive segmentation of MRI data. IEEE Transactions on Medical Imaging. 15 (4), 429-442 (1996).
- Agarwal, S. K., Singh, S., Ghuman, S. S., Sharma, S., Lahiri, A. K. Radiological assessment of the Indian children with congenital sensorineural hearing loss. International Journal of Otolaryngology. 2014, 808759 (2014).
- Mansfield, P., Maudsley, A. A. Medical imaging by NMR. The British Journal of Radiology. 50 (591), 188-194 (1977).
- Plewes, D. B., Kucharczyk, W. Physics of MRI: a primer. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 35 (5), 1038-1054 (2012).
- Batteux, C., Haidar, M. A., Bonnet, D. 3D-Printed Models for Surgical Planning in Complex Congenital Heart Diseases: A Systematic Review. Frontiers in Pediatrics. 7, 23 (2019).
- Thibault, F., et al. MRI for surgical planning in patients with breast cancer who undergo preoperative chemotherapy. American Journal of Roentgenology. 183 (4), 1159-1168 (2004).
- Oliver, C. R., et al. A platform for artificial intelligence based identification of the extravasation potential of cancer cells into the brain metastatic niche. Lab on a Chip. 19 (7), 1162-1173 (2019).
- Gril, B., et al. Reactive astrocytic S1P3 signaling modulates the blood-tumor barrier in brain metastases. Nature Communications. 9 (1), 2705 (2018).
- Badilescu, S., Packirisamy, M. . BioMEMS: Science And Engineering Perspectives. , (2011).
- Liu, C. . Foundations of MEMS. 2nd edn. , (2012).
- Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (muBBB). Lab on a Chip. 12 (10), 1784-1792 (2012).
- Lockman, P. R., et al. Heterogeneous blood-tumor barrier permeability determines drug efficacy in experimental brain metastases of breast cancer. Clinical Cancer Research. 16 (23), 5664-5678 (2010).
- Ryan Oliver, C., W, T. M. Con-tom: A Jupyter Notebook for Analyzing the tumor micro-environment in confocal images. Zenodo. , (2020).
- Lorensen, W. E., Johnson, C., Kasik, D., Whitton, M. C. History of the Marching Cubes Algorithm. IEEE Computer Graphics and Applications. 40 (2), 8-15 (2020).
- Kleinbaum, D. G., Kupper, L. L. . Applied regression analysis and other multivariable methods. , (1978).
- Berg, M. d. . Computational geometry : algorithms and applications, 2nd rev. edn. , (2000).
- Esch, M. B., Post, D. J., Shuler, M. L., Stokol, T. Characterization of in vitro endothelial linings grown within microfluidic channels. Tissue Engineering Part A. 17 (23-24), 2965-2971 (2011).
- Brinkley, B. R., et al. Variations in cell form and cytoskeleton in human breast carcinoma cells in vitro. 암 연구학. 40 (9), 3118-3129 (1980).
- Eigenmann, D. E., et al. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids and Barriers of the Central Nervous System. 10 (1), 33 (2013).
- Griep, L. M., et al. BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomedical Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).
- Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids and Barriers of the Central Nervous System. 10 (1), 16 (2013).
- Dello Russo, C., et al. The human microglial HMC3 cell line: where do we stand? A systematic literature review. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 259 (2018).
- Dun, M. D., et al. Proteotranscriptomic Profiling of 231-BR Breast Cancer Cells: Identification of Potential Biomarkers and Therapeutic Targets for Brain Metastasis. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (9), 2316-2330 (2015).
- Xing, F., et al. Reactive astrocytes promote the metastatic growth of breast cancer stem-like cells by activating Notch signalling in brain. EMBO Molecular Medicine. 5 (3), 384-396 (2013).
- Zhang, B., Radisic, M. Organ-on-a-chip devices advance to market. Lab on a Chip. 17 (14), 2395-2420 (2017).
