使用有机体片 3D 模型、机器学习和共声断层扫描量化脑转移肿瘤微环境
Summary
在这里，我们提出了一个协议，用于准备和培养血脑屏障转移肿瘤微环境，然后使用共体成像和人工智能（机器学习）量化其状态。
Abstract
脑转移是最致命的癌症病变;10-30%的癌症转移至大脑，平均存活期只有+5-20个月，取决于癌症类型。为了减少大脑转移性肿瘤负担，需要解决基本和转化知识方面的差距。主要挑战包括缺乏可重复的临床前模型和相关工具。脑转移的三维模型可以生成相关的分子和表型数据，用于满足这些需求，结合专用分析工具。此外，与穆林模型相比，患者肿瘤细胞穿过血脑屏障进入大脑微环境的细胞器官模型产生快速的结果，并且更可解释定量方法，从而适合高通量测试。在这里，我们描述并演示了一种新的3D微流体血脑利基（μmBBN）平台的使用，其中利基的多个元素可以培养很长一段时间（几天），荧光成像由共和显微镜，并使用创新的共体断层扫描技术重建的图像;所有旨在了解微转移的发展以及肿瘤微环境（TME）的变化，以可重复和定量的方式。我们演示如何使用这个平台制造、播种、图像和分析癌细胞和 TME 细胞和体液成分。此外，我们展示人工智能 （AI） 如何用于识别能够通过模型 μmBBN 传递的癌细胞的内在表型差异，并为它们分配一个脑转移潜力的客观索引。此方法生成的数据集可用于回答有关转移、治疗策略的疗效以及 TME 在两者中的作用的基本和转化问题。
Introduction
脑转移是最致命的癌症病变;10-30%的癌症转移至大脑，平均存活期只有+5-20个月，取决于癌症类型,1，2。研究癌症转移时出现的一个主要问题是亚克隆如何从血液的幽默环境迁移到大脑3、4,等器官。这个问题导致了许多迁移、入侵和外向分析的变体。所有这些方法都共享计数或测量细胞属性的关键步骤，这些细胞会根据刺激从一个位置移动到另一个位置。大多数现成的迁移测定都用于研究癌细胞的二维（2D）迁移。这些都阐明了丰富的知识;然而，它们并没有概括体内系统的三维性质，其他方法可以提供5。因此，有必要研究三维（3D）系统中的肿瘤微环境（TME），但可用于三维结构的分析方法有限，而且往往不一致。
最流行的3D工具之一是博伊登腔室，它由悬浮在井底的膜组成，将两个不同的区域隔开。博伊登介绍了研究白细胞化疗的测定方法。底部区域可以通过化学或其他方法6、7,来变化，以诱导上部区域的细胞迁移到下部区域。量化迁移的细胞数的最常见方法是使用缓冲液从膜底部释放细胞，对它们进行解，然后根据溶液7中的DNA含量量进行计数。这种间接方法由于技术变异性而容易出现操作者错误，该过程会破坏有关癌症表型和微环境的信息。博伊登腔室测定的变化涉及固定留在膜上的迁徙细胞，但只提供不再可行的细胞计数，以继续研究6，8，9。,8,9
由于博伊登腔室的局限性和微流体社区创新的增长，迁移测定芯片已经开发出来，观察细胞的运动，以响应一个方向的刺激，而不是三个10，11，12。,11,12这些迁移测定有助于控制诸如流动或单细胞分离等因子13、14，14从而更好地解释结果;13然而，它们的2D格式不可避免地会丢失一些动态信息。最近的研究集中在3D环境中的外在（即细胞从循环运动到组织，如血脑屏障）14，15。,15与使用博伊登腔室或2D微流体迁移装置16收集的测量结果，在细胞屏障/膜上发生的组织外向距离和探测行为更为精细。因此，能够对 3D 外创进行适当成像和分析的设备对于捕获这些复杂的测量值至关重要，但缺乏文献。
独立于迁移测定，已经开发出强大的成像技术，用于磁共振成像（MRI）和断层扫描，能够识别和准确地重建组织在3D空间17，18。,18这些技术根据组织的属性获取 z 堆栈中的图像和分割部分图像，然后将分割的图像转换为三维网格 19、20、21。19,20,21这使得医生能够可视化在3D个别器官，骨骼和血管，以帮助手术规划或协助诊断癌症或心脏病22，23。22,在这里，我们将展示这些方法可以适用于显微标本和3D外创装置。
为此，我们开发了创新的共声断层扫描技术，该技术提供了灵活性，通过调整现有的断层扫描工具，研究肿瘤细胞在膜上外向。这种方法能够研究癌细胞行为与细胞屏障（如内皮细胞层）相互作用时的全部范围。癌细胞表现出探测行为;有些可能入侵，但保持接近膜，而其他人很容易穿过屏障。这项技术能够产生关于细胞在所有维度24中的表型的信息。与更复杂的体内穆林模型相比，使用这种方法研究TME既相对便宜，易于解释，又可重复。提出的方法应该为通过适应肿瘤区域来研究许多类型的肿瘤和微环境提供强有力的基础。
我们描述并演示了3D微流体血脑利基（μmBBN）平台（图1），其中屏障和利基的关键元素（脑微血管内皮细胞和星形细胞）可以培养一个较长的时间（大约9天），由共和显微镜荧光成像，并使用我们的共体断层扫描技术重建的图像（图2）;都旨在以可重复和定量的方式了解微转移的发展以及肿瘤微环境的变化。血脑屏障与大脑利基的界面由脑微血管内皮细胞组成，这些细胞通过地下室膜、星形细胞脚和百分细胞25加强。我们选择性地关注星细胞和内皮成分，因为它们在血脑屏障的形成和调节中的重要性。我们演示如何利用这个平台制造、播种、图像和分析癌细胞和肿瘤微环境细胞和体液成分。最后，我们展示如何使用机器学习来识别能够通过模型μmBBN传递的癌细胞的内在表型差异，并赋予它们大脑转移电位24的客观索引。此方法生成的数据集可用于回答有关转移、治疗策略和 TME 在这两者中的作用的基本和转化问题。
Protocol
Representative Results
Discussion
我们开发并提出了一种新方法，可以调整临床成像分析中经常使用的工具，以测量癌细胞通过内皮屏障进入脑组织外创和迁移。我们认为这种方法对体内和体外测量都很有用;我们已经证明了它在3D微流体系统上重新验证脑血管的用途。癌细胞测量，包括距离外创，体积外创百分比，球面和体积使用这种技术进行量化。距离外在和体积外加百分比允许用户重建芯片中癌细胞的位置，以评估跨越屏障?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢国家癌症研究所的斯蒂格实验室慷慨捐赠MDA-MB-231-BR-GFP细胞。在密歇根大学生物接口研究所（BI）进行了共生显微镜。在密歇根大学流细胞学核心进行流细胞学。病毒载体是由密歇根大学病媒核心创建。我们还感谢凯利·基德威尔对这些数据的统计分析提供指导。
资金：
C.R.O.部分得到国家卫生和三十二培训研究金（T32CA009676）和1R21CA245597-01的支助。T.M.W. 部分得到 1R21CA245597-01 和国家卫生研究院国家促进转化科学中心的支持，奖励编号为 UL1TR002240。国家卫生研究院国家癌症研究所根据奖号1R21CA245597-01、P30CA046592、5T32CA009676-23、CA196018、AI116482、METAvivor基金会和乳腺癌研究基金会提供了材料和表征的资助。内容完全由作者负责，不一定代表国家卫生研究院的官方观点
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA with phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| 1.5 mm biopsy punch with plunger | Integra LifeSciences Corporation | 33-31A-P/25 | |
| 10x MEM | Thermo Fisher Scientific | 11430030 | |
| 150 mm petri dishes | Fisher Scientific | FB0875714 | |
| 1x DPBS, without Ca and Mg | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
| 200uL pipette tip | Fisher Scientific | 02-707-411 | |
| 4 inch silicon wafer | University Wafer | 452 | |
| 48 mm wide packing tape | Fisher Scientific | 19-072-097 | |
| 50 x 75 mm glass slide | Fisher Scientific | 12-550C | |
| A1 confocal microscope | Nikon | ||
| acetone | Fisher Scientific | A9-20 | |
| antibiotic/antimycotic (penicillin/streptomycin/amphotericin) | Gibco | 15240062 | |
| box cutter blade | Fisher Scientific | NC1721575 | |
| dissection scissors | Fisher Scientific | 08-951-5 | |
| DMEM with 4.5 g/L glucose | Thermo Fisher Scientific | 11960-044 | |
| double sided tape | Fisher Scientific | NC0879005 | |
| EGM-2 | Lonza | CC-3162 | |
| Fetal Bovine Serum, Heat inactivated | Corning | MT35011CV | |
| Fiji software | ImageJ | ||
| glass vial | Fisher Scientific | 03-341-25D | |
| glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| hCMEC/D3 | EMD Millipore | SCC066 | |
| Jupyter notebook | Anaconda | ||
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| Matrigel – growth factor reduced with phenol red | Corning | CB-40230A | |
| MDA-MB-231 | ATCC | HTB-26 | |
| MDA-MB-231-BR-GFP | Dr. Patricia Steeg, NIH | ||
| N-2 growth supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| normal human astrocytes (NHA) | Lonza | CC-2565 | |
| Orange software | University of Ljubljana | ||
| Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-711-9AM | |
| Photolithography masks | Photosciences Incorporated | ||
| pLL3.7-dsRed | University of Michigan Vector Core | ||
| pLL-EV-GFP | University of Michigan Vector Core | ||
| pLOX-TERT-iresTK | Addgene | 12245 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| polycarbonate membrane, 5um pore size | Millipore | TMTP04700 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| PureCol, 3 mg/mL | Advanced Biomatrix | 5005 | Type I bovine collagen |
| sodium bicarbonate | Thermo Fisher Scientific | 25080094 | |
| sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | |
| Solo cup | Fisher Scientific | NC1416545 | |
| SU-8 2075 | MicroChem Corporation | Y111074 0500L1GL | |
| SU8 developer | MicroChem Corporation | Y020100 4000L1PE | |
| Sylgard 184 | Ellsworth Adhesive Company | NC0162601 | |
| Toluene | Sigma-Aldrich | 179965-1L | |
| Tricholoro perfluoro octyl silane | Sigma-Aldrich | 448931-10G |
References
- Rastogi, K., et al. Palliation of Brain Metastases: Analysis of Prognostic Factors Affecting Overall Survival. Indian Journal of Palliative Care. 24 (3), 308-312 (2018).
- Wang, R., et al. The Clinicopathological features and survival outcomes of patients with different metastatic sites in stage IV breast cancer. BMC Cancer. 19 (1), 1091 (2019).
- Valster, A., et al. Cell migration and invasion assays. Methods. 37 (2), 208-215 (2005).
- Eccles, S. A., Box, C., Court, W. Cell migration/invasion assays and their application in cancer drug discovery. Biotechnology Annual Review. 11, 391-421 (2005).
- Brekhman, V., Neufeld, G. A novel asymmetric 3D in-vitro assay for the study of tumor cell invasion. BMC Cancer. 9, 415 (2009).
- Chen, H. C. Boyden chamber assay. Methods in Molecular Biology. 294, 15-22 (2005).
- Poissonnier, A., Legembre, P. Boyden Chamber Assay to Study of Cell Migration Induced by Metalloprotease Cleaved-CD95L. Methods in Molecular Biology. 1557, 117-123 (2017).
- Li, X., Yang, H., Huang, H., Zhu, T. CELLCOUNTER: novel open-source software for counting cell migration and invasion in vitro. BioMed Research International. 2014, 863564 (2014).
- Little, A. C., et al. IL-4/IL-13 Stimulated Macrophages Enhance Breast Cancer Invasion Via Rho-GTPase Regulation of Synergistic VEGF/CCL-18 Signaling. Frontiers in Oncology. 9, 456 (2019).
- Allen, S. G., et al. Macrophages Enhance Migration in Inflammatory Breast Cancer Cells via RhoC GTPase Signaling. Scientific Reports. 6, 39190 (2016).
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Chen, Y. C., et al. Single-cell Migration Chip for Chemotaxis-based Microfluidic Selection of Heterogeneous Cell Populations. Scientific Reports. 5, 9980 (2015).
- Choi, Y. P., et al. Cancer-associated fibroblast promote transmigration through endothelial brain cells in three-dimensional in vitro models. International Journal of Cancer. 135 (9), 2024-2033 (2014).
- Takeshita, Y., et al. An in vitro blood-brain barrier model combining shear stress and endothelial cell/astrocyte co-culture. Journal of Neuroscience Methods. 232, 165-172 (2014).
- Kienast, Y., et al. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nature Medicine. 16 (1), 116-122 (2010).
- Schroeder, W., Martin, K., Lorenson, B. . The Visualization Toolkit. 4th edn. , (2006).
- Wells, W. M., Grimson, W. L., Kikinis, R., Jolesz, F. A. Adaptive segmentation of MRI data. IEEE Transactions on Medical Imaging. 15 (4), 429-442 (1996).
- Agarwal, S. K., Singh, S., Ghuman, S. S., Sharma, S., Lahiri, A. K. Radiological assessment of the Indian children with congenital sensorineural hearing loss. International Journal of Otolaryngology. 2014, 808759 (2014).
- Mansfield, P., Maudsley, A. A. Medical imaging by NMR. The British Journal of Radiology. 50 (591), 188-194 (1977).
- Plewes, D. B., Kucharczyk, W. Physics of MRI: a primer. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 35 (5), 1038-1054 (2012).
- Batteux, C., Haidar, M. A., Bonnet, D. 3D-Printed Models for Surgical Planning in Complex Congenital Heart Diseases: A Systematic Review. Frontiers in Pediatrics. 7, 23 (2019).
- Thibault, F., et al. MRI for surgical planning in patients with breast cancer who undergo preoperative chemotherapy. American Journal of Roentgenology. 183 (4), 1159-1168 (2004).
- Oliver, C. R., et al. A platform for artificial intelligence based identification of the extravasation potential of cancer cells into the brain metastatic niche. Lab on a Chip. 19 (7), 1162-1173 (2019).
- Gril, B., et al. Reactive astrocytic S1P3 signaling modulates the blood-tumor barrier in brain metastases. Nature Communications. 9 (1), 2705 (2018).
- Badilescu, S., Packirisamy, M. . BioMEMS: Science And Engineering Perspectives. , (2011).
- Liu, C. . Foundations of MEMS. 2nd edn. , (2012).
- Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (muBBB). Lab on a Chip. 12 (10), 1784-1792 (2012).
- Lockman, P. R., et al. Heterogeneous blood-tumor barrier permeability determines drug efficacy in experimental brain metastases of breast cancer. Clinical Cancer Research. 16 (23), 5664-5678 (2010).
- Ryan Oliver, C., W, T. M. Con-tom: A Jupyter Notebook for Analyzing the tumor micro-environment in confocal images. Zenodo. , (2020).
- Lorensen, W. E., Johnson, C., Kasik, D., Whitton, M. C. History of the Marching Cubes Algorithm. IEEE Computer Graphics and Applications. 40 (2), 8-15 (2020).
- Kleinbaum, D. G., Kupper, L. L. . Applied regression analysis and other multivariable methods. , (1978).
- Berg, M. d. . Computational geometry : algorithms and applications, 2nd rev. edn. , (2000).
- Esch, M. B., Post, D. J., Shuler, M. L., Stokol, T. Characterization of in vitro endothelial linings grown within microfluidic channels. Tissue Engineering Part A. 17 (23-24), 2965-2971 (2011).
- Brinkley, B. R., et al. Variations in cell form and cytoskeleton in human breast carcinoma cells in vitro. 암 연구학. 40 (9), 3118-3129 (1980).
- Eigenmann, D. E., et al. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids and Barriers of the Central Nervous System. 10 (1), 33 (2013).
- Griep, L. M., et al. BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomedical Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).
- Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids and Barriers of the Central Nervous System. 10 (1), 16 (2013).
- Dello Russo, C., et al. The human microglial HMC3 cell line: where do we stand? A systematic literature review. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 259 (2018).
- Dun, M. D., et al. Proteotranscriptomic Profiling of 231-BR Breast Cancer Cells: Identification of Potential Biomarkers and Therapeutic Targets for Brain Metastasis. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (9), 2316-2330 (2015).
- Xing, F., et al. Reactive astrocytes promote the metastatic growth of breast cancer stem-like cells by activating Notch signalling in brain. EMBO Molecular Medicine. 5 (3), 384-396 (2013).
- Zhang, B., Radisic, M. Organ-on-a-chip devices advance to market. Lab on a Chip. 17 (14), 2395-2420 (2017).
