JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
암 연구학

Kvantificering af hjernen metastatisk tumor mikro-miljø ved hjælp af en organ-on-a chip 3D-model, machine learning, og konfokal tomografi

Published: August 16, 2020
doi:
10.3791/61654
, , ,
1Department of Internal Medicine,University of Michigan Ann Arbor, 2Rogel Cancer Center,University of Michigan Ann Arbor, 3Department of Neurosurgery,University of Michigan Ann Arbor, 4Department of Cell and Developmental Biology,University of Michigan Ann Arbor

Summary

Her præsenterer vi en protokol for forberedelse og dyrkning af en blod-hjerne barriere metastatisk tumor mikro-miljø og derefter kvantificere sin tilstand ved hjælp af konfokale billeddannelse og kunstig intelligens (machine learning).

Abstract

Hjernemetastaser er de mest dødelige kræftlæsioner; 10-30% af alle kræftformer metastaserer til hjernen, med en median overlevelse på kun ~ 5-20 måneder, afhængigt af kræfttype. For at reducere hjernen metastatisk tumor byrde, huller i grundlæggende og translationel viden skal løses. Store udfordringer omfatter en mangel på reproducerbare prækliniske modeller og tilhørende værktøjer. Tredimensionelle modeller af hjernemetastase kan give de relevante molekylære og fænotopypiske data, der bruges til at imødekomme disse behov, når de kombineres med dedikerede analyseværktøjer. Desuden, sammenlignet med murine modeller, organ-on-a-chip modeller af patient tumorceller gennemkører blod-hjerne barrieren i hjernen mikromiljø generere resultater hurtigt og er mere fortolkes med kvantitative metoder, således modtagelige for høj gennemløb test. Her beskriver og demonstrerer vi brugen af en ny 3D-mikrofluidic blodtaopni -platform (μmBBN) platform, hvor flere elementer i nichen kan dyrkes i en længere periode (flere dage), fluorescerende afbildet af konfokal mikroskopi og billederne rekonstrueret ved hjælp af en innovativ konfokal tomografiteknik; alle havde til formål at forstå udviklingen af mikro-metastase og ændringer i tumor mikro-miljø (TME) i en repeterbar og kvantitativ måde. Vi demonstrerer, hvordan man fabrikere, frø, billede, og analysere kræftceller og TME cellulære og humorelle komponenter, ved hjælp af denne platform. Desuden viser vi, hvordan kunstig intelligens (AI) bruges til at identificere de iboende fænofyrste forskelle i kræftceller, der er i stand til at passere gennem en model μmBBN og til at tildele dem et objektivt indeks over hjernens metastatiske potentiale. De datasæt, der genereres ved denne metode, kan bruges til at besvare grundlæggende og translationelle spørgsmål om metastase, effekten af terapeutiske strategier og TME’s rolle i begge.

Introduction

Hjernemetastaser er de mest dødelige kræftlæsioner; 10-30% af alle kræftformer metastaserer til hjernen, med en median overlevelse på kun ~ 5-20 måneder, afhængigt af kræft type1,,2. Et hovedspørgsmål, der opstår, når man studerer kræftmetastase er, hvordan sub kloner migrere fra humoral miljø i blodbanen i et organ som hjernen3,4. Dette spørgsmål har ført til mange variationer af migration, invasion, og ekstravasation assays. Alle disse metoder deler det kritiske trin for at tælle eller måle egenskaber af celler, der flytter fra et sted til et andet som reaktion på en stimulus. De fleste migration assays let tilgængelige bruges til at studere to-dimensionelle (2D) migration af kræftceller. Disse har belyst et væld af viden; De opsummerer dog ikke in vivo-systemets tredimensionelle karakter, som andre metoder kan give5. Derfor er det nødvendigt at studere tumor mikro-miljø (TME) i tre-dimensionelle (3D) systemer, men analysen tilgange til rådighed for 3D-strukturer er begrænsede og ofte inkonsekvent.

Et af de mest populære 3D-værktøjer er et Boyden kammer, der består af en membran suspenderet i bunden af en brønd, der adskiller to forskellige regioner. Boyden introducerede analysen for at studere leukocyt chemotaxis4. De nederste regioner kan varieres efter kemi eller på andenmåde 6,7 for at få celler i den øvre region til at migrere til den nedre region. Den mest almindelige metode til at kvantificere antallet af celler, der har migreret, er at frigive cellerne fra bunden af membranen ved hjælp af en bufferløsning, lyse dem, og derefter tælle dem baseret på mængden af DNA-indhold iopløsningen 7. Denne indirekte tilgang er tilbøjelig til operatørfejl på grund af teknikvariation, og proceduren ødelægger oplysninger om kræftfæstypen og mikromiljøet. Variationer af Boyden kammer assay indebærer fiksering af migrerende celler, der forbliver på membranen, men giver kun en optælling af celler, der ikke længere er levedygtige for fortsat undersøgelse6,8,9.

På grund af begrænsninger i Boyden kammer og væksten af innovationer i mikrofluidic samfund, migration assay chips er blevet udviklet som observerer bevægelse af celler som reaktion på en stimulus i én retning i stedet fortre 10,11,12. Disse migrationsanalyser letter kontrollen over faktorer som flow eller enkeltcelleseparation13,14, der muliggør en bedre fortolkning af resultaterne., men deres 2D-format uundgåeligt mister nogle dynamiske oplysninger. Nylige undersøgelser har fokuseret på ekstravasation (dvs. flytning af celler fra omsætning til et væv, såsom blod-hjerne barrieren) i et 3D-miljø14,,15. Ekstravasationen afstand til væv og sondering adfærd, der opstår på den cellulære barriere / membran er mere raffineret end målinger udledes ved hjælp af enten Boyden kammer eller en 2D microfluidic migration enhed16. Således er enheder, der muliggør passende billedbehandling og analyse af 3D-ekstravasation, afgørende for at fange disse avancerede målinger, men mangler i litteraturen.

Uafhængigt af migrationsanalyser er der udviklet robuste billeddannelsesteknikker til mri-billeddannelse (magnetic resonans imaging) og tomografi, der er i stand til at identificere og nøjagtigt rekonstruere væv i 3D-rum17,18. Disse teknikker erhverve billeder i z-stakke og segment dele af billedet baseret på egenskaberne af vævet og derefter konvertere de opdelte billeder i tre-dimensionelle masker19,20,21. Dette gør det muligt for læger at visualisere i 3D individuelle organer, knogler og fartøjer til støtte i kirurgisk planlægning eller støtte i diagnosticering af kræft ellerhjertesygdomme 22,23. Her vil vi vise, at disse tilgange kan tilpasses til brug på mikroskopiske prøver og 3D-udstyrsenheder.

Til dette formål udviklede vi den innovative konfokale tomografi teknik, præsenteret heri, som giver fleksibilitet til at studere ekstravasation af tumorceller på tværs af en membran ved at tilpasse eksisterende tomografi værktøjer. Denne fremgangsmåde gør det muligt at studere den fulde vifte af kræft celle adfærd, som de interagerer med en cellulær barriere, såsom en endotel cellelag. Kræftceller udviser sondering adfærd; nogle kan invadere, men forblive tæt på membranen, mens andre krydser barrieren let. Denne teknik er i stand til at give oplysninger om fænotype af cellen i alle dimensioner24. Ved hjælp af denne tilgang til at studere TME er både relativt billigt, let at fortolke, og reproducerbare, sammenlignet med mere komplekse in vivo murine modeller. Den præsenterede metode bør give et stærkt grundlag for studiet af mange typer af tumorer og mikro-miljøer ved at tilpasse den stromale region.

Vi beskriver og demonstrerer brugen af en 3D-mikrofluidic blodtaopni -platform (μmBBN) platform (figur1), hvor kritiske elementer i barrieren og nichen (hjernemikalieotolære endotelceller og astrocytter) kan dyrkes i en længere periode (ca. op til 9 dage), fluorescerende afbildet af konkorkal mikroskopi og billederne rekonstrueret ved hjælp af vores konfokale tomografiteknik (figur 2); alle havde til formål at forstå udviklingen af mikro-metastase og ændringer i tumor mikro-miljø i en repeterbar og kvantitativ måde. Blod-hjerne barrieren interface med hjernen niche er sammensat af hjernen mikrovaskulære endotelceller, der er styrket af kælderen membran, astrocyte fødder, og pericytes25. Vi fokuserede selektivt på astrocyt- og endotelkomponenterne i betragtning af deres betydning i dannelsen og reguleringen af blod-hjernebarrieren. Vi demonstrerer, hvordan man fabrikere, frø, billede, og analysere kræftceller og tumor mikro-miljø cellulære og humorelle komponenter, ved hjælp af denne platform. Endelig viser vi, hvordan machine learning kan bruges til at identificere de iboende fænofyrste forskelle i kræftceller, der er i stand til transit gennem en model μmBBN og til at tildele dem et objektivt indeks af hjernen metastatisk potentiale24. De datasæt, der genereres ved denne metode, kan bruges til at besvare grundlæggende og translationelle spørgsmål om metastase, terapeutiske strategier og TME’s rolle i begge.

Protocol

1. Forbered blod-hjerne barrieren niche skimmel BEMÆRK: Den dyrkning enhed, der anvendes i denne platform er en PDMS baseret stillads, at vi bygger en cellulær blod hjerne barriere niche på. Det er lavet af to dele adskilt af en porøs membran. For at forberede blod-hjerne barrieren niche to SU-8 forme lavet ved hjælp af fotolitografi er nødvendige26,27. Protokollen vil blive beskrevet for 100 μm tyk skimmel først og derefter note…

Representative Results

Ved hjælp af denne teknik analyserede vi celletyper mærket med forskellige fluorescerende proteiner eller farvestoffer. Vi demonstrerer brugen af denne fremgangsmåde med en μmBBN chip formuleret med hCMEC/D3-DSRed og ikke-fluorescerende astrocytter. De mikrovaskulære endotelceller i hjernen blev seedet på en porøs membran (5 μm spor ætsede porer) og anbragt i en inkubator34 ved 37 °C under 5% CO2. Efter tre dage blev sammenløbet af endotellaget bekræftet via mikroskopi, og d…

Discussion

Vi har udviklet og præsenteret en ny metode, der tilpasser værktøjer, der ofte anvendes i kliniske billedanalyser til måling af ekstravasation og migration af kræftceller gennem en endotelbarriere til hjernevæv. Vi udgør denne fremgangsmåde kan være nyttig for både in vivo og in vitro målinger; vi har vist sin anvendelse på en 3D microfluidic system recapitulating hjernen vaskulatur. Kræft celle målinger, herunder afstand ekstravaseret, procent ekstravaseret af volumen, sfæriskhed, og volumen er kvantifice…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker Steeg Lab, på National Cancer Institute for den generøse donation af MDA-MB-231-BR-GFP celler. Konfokal mikroskopi blev udført på University of Michigan Biointerfaces Institute (BI). Flow cytometri blev udført på University of Michigan Flow Cytometri Core. Virale vektorer blev skabt af University of Michigan Vector Core. Vi takker også Kelley Kidwell for vejledning i statistisk analyse af disse data.

Finansiering:

C.R.O. blev delvist støttet af et NIH T-32 Training Fellowship (T32CA009676) og 1R21CA245597-01. T.M.W. blev delvist støttet af 1R21CA245597-01 og National Center for Advancing Translational Sciences fra National Institutes of Health under Award Number UL1TR002240. Finansiering af materialer og karakterisering blev leveret af National Cancer Institutes of National Institutes of Health under tildeling nummer 1R21CA245597-01, P30CA046592, 5T32CA009676-23, CA196018, AI116482, METAvivor Foundation, og Breast Cancer Research Foundation. Indholdet er udelukkende ophavsmændenes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter fra de nationale sundhedsinstitutter

Materials

0.25% Trypsin-EDTA with phenol red Thermo Fisher Scientific 25200056
1.5 mm biopsy punch with plunger Integra LifeSciences Corporation 33-31A-P/25
10x MEM Thermo Fisher Scientific 11430030
150 mm petri dishes Fisher Scientific FB0875714
1x DPBS, without Ca and Mg Thermo Fisher Scientific 14190144
200uL pipette tip Fisher Scientific 02-707-411
4 inch silicon wafer University Wafer 452
48 mm wide packing tape Fisher Scientific 19-072-097
50 x 75 mm glass slide Fisher Scientific 12-550C
A1 confocal microscope Nikon
acetone Fisher Scientific A9-20
antibiotic/antimycotic (penicillin/streptomycin/amphotericin) Gibco 15240062
box cutter blade Fisher Scientific NC1721575
dissection scissors Fisher Scientific 08-951-5
DMEM with 4.5 g/L glucose Thermo Fisher Scientific 11960-044
double sided tape Fisher Scientific NC0879005
EGM-2 Lonza CC-3162
Fetal Bovine Serum, Heat inactivated Corning MT35011CV
Fiji software ImageJ
glass vial Fisher Scientific 03-341-25D
glutamax Thermo Fisher Scientific 35050061
hCMEC/D3 EMD Millipore SCC066
Jupyter notebook Anaconda
L-glutamine Thermo Fisher Scientific 25030081
Matrigel – growth factor reduced with phenol red Corning CB-40230A
MDA-MB-231 ATCC HTB-26
MDA-MB-231-BR-GFP Dr. Patricia Steeg, NIH
N-2 growth supplement Thermo Fisher Scientific 17502048
normal human astrocytes (NHA) Lonza CC-2565
Orange software University of Ljubljana
Pasteur pipette Fisher Scientific 13-711-9AM
Photolithography masks Photosciences Incorporated
pLL3.7-dsRed University of Michigan Vector Core
pLL-EV-GFP University of Michigan Vector Core
pLOX-TERT-iresTK Addgene 12245
pMD2.G Addgene 12259
polycarbonate membrane, 5um pore size Millipore TMTP04700
psPAX2 Addgene 12260
PureCol, 3 mg/mL Advanced Biomatrix 5005 Type I bovine collagen
sodium bicarbonate Thermo Fisher Scientific 25080094
sodium pyruvate Thermo Fisher Scientific 11360070
Solo cup Fisher Scientific NC1416545
SU-8 2075 MicroChem Corporation Y111074 0500L1GL
SU8 developer MicroChem Corporation Y020100 4000L1PE
Sylgard 184 Ellsworth Adhesive Company NC0162601
Toluene Sigma-Aldrich 179965-1L
Tricholoro perfluoro octyl silane Sigma-Aldrich 448931-10G
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rastogi, K., et al. Palliation of Brain Metastases: Analysis of Prognostic Factors Affecting Overall Survival. Indian Journal of Palliative Care. 24 (3), 308-312 (2018).
  2. Wang, R., et al. The Clinicopathological features and survival outcomes of patients with different metastatic sites in stage IV breast cancer. BMC Cancer. 19 (1), 1091 (2019).
  3. Valster, A., et al. Cell migration and invasion assays. Methods. 37 (2), 208-215 (2005).
  4. Eccles, S. A., Box, C., Court, W. Cell migration/invasion assays and their application in cancer drug discovery. Biotechnology Annual Review. 11, 391-421 (2005).
  5. Brekhman, V., Neufeld, G. A novel asymmetric 3D in-vitro assay for the study of tumor cell invasion. BMC Cancer. 9, 415 (2009).
  6. Chen, H. C. Boyden chamber assay. Methods in Molecular Biology. 294, 15-22 (2005).
  7. Poissonnier, A., Legembre, P. Boyden Chamber Assay to Study of Cell Migration Induced by Metalloprotease Cleaved-CD95L. Methods in Molecular Biology. 1557, 117-123 (2017).
  8. Li, X., Yang, H., Huang, H., Zhu, T. CELLCOUNTER: novel open-source software for counting cell migration and invasion in vitro. BioMed Research International. 2014, 863564 (2014).
  9. Little, A. C., et al. IL-4/IL-13 Stimulated Macrophages Enhance Breast Cancer Invasion Via Rho-GTPase Regulation of Synergistic VEGF/CCL-18 Signaling. Frontiers in Oncology. 9, 456 (2019).
  10. Allen, S. G., et al. Macrophages Enhance Migration in Inflammatory Breast Cancer Cells via RhoC GTPase Signaling. Scientific Reports. 6, 39190 (2016).
  11. Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
  12. Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
  13. Chen, Y. C., et al. Single-cell Migration Chip for Chemotaxis-based Microfluidic Selection of Heterogeneous Cell Populations. Scientific Reports. 5, 9980 (2015).
  14. Choi, Y. P., et al. Cancer-associated fibroblast promote transmigration through endothelial brain cells in three-dimensional in vitro models. International Journal of Cancer. 135 (9), 2024-2033 (2014).
  15. Takeshita, Y., et al. An in vitro blood-brain barrier model combining shear stress and endothelial cell/astrocyte co-culture. Journal of Neuroscience Methods. 232, 165-172 (2014).
  16. Kienast, Y., et al. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nature Medicine. 16 (1), 116-122 (2010).
  17. Schroeder, W., Martin, K., Lorenson, B. . The Visualization Toolkit. 4th edn. , (2006).
  18. Wells, W. M., Grimson, W. L., Kikinis, R., Jolesz, F. A. Adaptive segmentation of MRI data. IEEE Transactions on Medical Imaging. 15 (4), 429-442 (1996).
  19. Agarwal, S. K., Singh, S., Ghuman, S. S., Sharma, S., Lahiri, A. K. Radiological assessment of the Indian children with congenital sensorineural hearing loss. International Journal of Otolaryngology. 2014, 808759 (2014).
  20. Mansfield, P., Maudsley, A. A. Medical imaging by NMR. The British Journal of Radiology. 50 (591), 188-194 (1977).
  21. Plewes, D. B., Kucharczyk, W. Physics of MRI: a primer. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 35 (5), 1038-1054 (2012).
  22. Batteux, C., Haidar, M. A., Bonnet, D. 3D-Printed Models for Surgical Planning in Complex Congenital Heart Diseases: A Systematic Review. Frontiers in Pediatrics. 7, 23 (2019).
  23. Thibault, F., et al. MRI for surgical planning in patients with breast cancer who undergo preoperative chemotherapy. American Journal of Roentgenology. 183 (4), 1159-1168 (2004).
  24. Oliver, C. R., et al. A platform for artificial intelligence based identification of the extravasation potential of cancer cells into the brain metastatic niche. Lab on a Chip. 19 (7), 1162-1173 (2019).
  25. Gril, B., et al. Reactive astrocytic S1P3 signaling modulates the blood-tumor barrier in brain metastases. Nature Communications. 9 (1), 2705 (2018).
  26. Badilescu, S., Packirisamy, M. . BioMEMS: Science And Engineering Perspectives. , (2011).
  27. Liu, C. . Foundations of MEMS. 2nd edn. , (2012).
  28. Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (muBBB). Lab on a Chip. 12 (10), 1784-1792 (2012).
  29. Lockman, P. R., et al. Heterogeneous blood-tumor barrier permeability determines drug efficacy in experimental brain metastases of breast cancer. Clinical Cancer Research. 16 (23), 5664-5678 (2010).
  30. Ryan Oliver, C., W, T. M. Con-tom: A Jupyter Notebook for Analyzing the tumor micro-environment in confocal images. Zenodo. , (2020).
  31. Lorensen, W. E., Johnson, C., Kasik, D., Whitton, M. C. History of the Marching Cubes Algorithm. IEEE Computer Graphics and Applications. 40 (2), 8-15 (2020).
  32. Kleinbaum, D. G., Kupper, L. L. . Applied regression analysis and other multivariable methods. , (1978).
  33. Berg, M. d. . Computational geometry : algorithms and applications, 2nd rev. edn. , (2000).
  34. Esch, M. B., Post, D. J., Shuler, M. L., Stokol, T. Characterization of in vitro endothelial linings grown within microfluidic channels. Tissue Engineering Part A. 17 (23-24), 2965-2971 (2011).
  35. Brinkley, B. R., et al. Variations in cell form and cytoskeleton in human breast carcinoma cells in vitro. 암 연구학. 40 (9), 3118-3129 (1980).
  36. Eigenmann, D. E., et al. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids and Barriers of the Central Nervous System. 10 (1), 33 (2013).
  37. Griep, L. M., et al. BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomedical Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).
  38. Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids and Barriers of the Central Nervous System. 10 (1), 16 (2013).
  39. Dello Russo, C., et al. The human microglial HMC3 cell line: where do we stand? A systematic literature review. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 259 (2018).
  40. Dun, M. D., et al. Proteotranscriptomic Profiling of 231-BR Breast Cancer Cells: Identification of Potential Biomarkers and Therapeutic Targets for Brain Metastasis. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (9), 2316-2330 (2015).
  41. Xing, F., et al. Reactive astrocytes promote the metastatic growth of breast cancer stem-like cells by activating Notch signalling in brain. EMBO Molecular Medicine. 5 (3), 384-396 (2013).
  42. Zhang, B., Radisic, M. Organ-on-a-chip devices advance to market. Lab on a Chip. 17 (14), 2395-2420 (2017).

Tags

Confocal TomographyMachine LearningOrgan-on-a-chipBrain MetastasisTumor MicroenvironmentCell BehaviorDiagnostic ToolMicrofluidic DeviceCollagenAstrocyteEndothelial CellsCell Culture

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Oliver, C. R., Westerhof, T. M., Castro, M. G., Merajver, S. D. Quantifying the Brain Metastatic Tumor Micro-Environment using an Organ-On-A Chip 3D Model, Machine Learning, and Confocal Tomography. J. Vis. Exp. (162), e61654, doi:10.3791/61654 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image