כימות המיקרו-סביבה של גידול גרורתי במוח באמצעות דגם תלת-מימד של שבב איבר-און-איי, למידת מכונה וטומוגרפיה קונפוקלית
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול להכנת ואיסוף של מחסום דם במוח גרורתי מיקרו סביבה ולאחר מכן לכמת את מצבה באמצעות הדמיה confocal ובינה מלאכותית (למידת מכונה).
Abstract
גרורות במוח הן נגעים סרטן הקטלני ביותר; 10-30% של כל סוגי הסרטן גרורות למוח, עם הישרדות חציון של רק ~ 5-20 חודשים, בהתאם לסוג הסרטן. כדי להפחית את נטל הגידול גרורתי במוח, פערים בידע בסיסי ותרגום צריך להיות מטופל. האתגרים העיקריים כוללים בעיה של מודלים פרה-לקלינליים לשחזור וכלים קשורים. מודלים תלת מימדיים של גרורות במוח יכולים להניב את הנתונים המולקולריים והפנוטיפיים הרלוונטיים המשמשים לטיפול בצרכים אלה בשילוב עם כלי ניתוח ייעודיים. יתר על כן, בהשוואה למודלים מורין, מודלים organ-on-a-שבב של תאים סרטניים המטופל חוצה את מחסום המוח בדם לתוך microenvironment המוח ליצור תוצאות במהירות, הם מתורגמים יותר עם שיטות כמותיות, ולכן ניתן לתפוקה גבוהה. כאן אנו מתארים ומדגימים את השימוש בפלטפורמת נישת מוח מיקרו-נוזלית תלת-מית-ייחודית רומן (μmBBN), שבה ניתן לתמרץ אלמנטים מרובים של הנישה לתקופה ממושכת (מספר ימים), התמונה הפלואורסצנטית על ידי מיקרוסקופית קונפוקסלית, והתמונות השיחזרו באמצעות טכניקת טומוגרפיה חדשנית וקונספוקלית; כל שמטרתו להבין את הפיתוח של מיקרו גרורות ושינויים בסביבת מיקרו הגידול (TME) באופן חוזר וכמותי. אנו מדגימים כיצד לפברק, זרע, תמונה, ולנתח את התאים הסרטניים ואת רכיבים תאיים והומוריסטיים TME, באמצעות פלטפורמה זו. יתר על כן, אנו מראים כיצד בינה מלאכותית (AI) משמשת לזיהוי ההבדלים הפנוטיים הפנימיים של תאים סרטניים המסוגלים לעבור דרך מודל μmBBN ולהקצות להם אינדקס אובייקטיבי של פוטנציאל גרורתי במוח. ניתן להשתמש ב ערכות הנתונים שנוצרו על ידי שיטה זו כדי לענות על שאלות בסיסיות ותרגום על גרורות, היעילות של אסטרטגיות טיפוליות, ואת התפקיד של TME בשניהם.
Introduction
גרורות במוח הן נגעים סרטן הקטלני ביותר; 10-30% של כל סוגי הסרטן גרורות למוח, עם הישרדות חציון של רק ~ 5-20 חודשים, בהתאםלסוג סרטן 1,,2. שאלה עיקרית המתעוררת בעת לימוד גרורות סרטן היא כיצד שיבוטים משנה לנדוד מהסביבה ההומוריסטית של מחזור הדםלתוך איבר כגוןהמוח 3,4. שאלה זו הובילה לווריאציות רבות של הגירה, פלישה ואסהרנות. כל השיטות הללו חולקות את השלב הקריטי של ספירה או מדידה של מאפיינים של תאים הלעבור ממיקום אחד למתו בתגובה לגירוי. רוב הנדידה זמינה משמשים לחקר הגירה דו מימדית (2D) של תאים סרטניים. אלה התרעו שפע של ידע; עם זאת, הם אינם לסיכום האופי התלת מימדי של מערכת vivo כי שיטות אחרות יכולות לספק5. לכן, יש צורך ללמוד את הגידול מיקרו-סביבה (TME) במערכות תלת מימדיות (3D), אבל גישות הניתוח זמין עבור מבנים 3D מוגבלים ולעתים קרובות לא עקבי.
אחד הכלים התת-מימד הפופולריים ביותר הוא תא ביידן המורכב מממברנה התלויה בתחתית באר, המפרידה בין שני אזורים נפרדים. ביידן הציג את ההסתה כדי ללמוד leukocyte chemotaxis4. האזורים הנמוכים עשויים להיות מגוונים לפי כימיה אואמצעים אחרים 6,7 כדי לגרום לתאים באזור העליון לעבור לאזור התחתון. הגישה הנפוצה ביותר לכמת את מספר התאים שהועברו היא לשחרר את התאים מתחתית הממברנה באמצעות פתרון מאגר, לכמת אותם, ולאחר מכן לספור אותם בהתבסס על כמות תוכן ה-DNAבפתרון 7. גישה עקיפה זו נוטה לשגיאה מפעיל בשל שונות טכניקה וההליך הורס מידע על פנוטיפ הסרטן ואת המיקרו-סביבה. וריאציות של ההסדה התא Boyden כרוכות קיבעון של תאים נודדים שנותרו על הממברנה, אבל רק מספק ספירה של תאים כי הם כבר לא קיימא להמשך מחקר6,,8,9.
בשל מגבלות של תא Boyden וצמיחת חידושים בקהילה microfluidic, שבבי אסיי הגירה פותחו אשר לבחון את תנועת התאים בתגובה לגירוי בכיוון אחד ולאשלוש 10,11,12. העברה זו מקלה על שליטה בגורמים כגון זרימה אוהפרדת תאים בודדים 13,14 המאפשרים פרשנות טובה יותר של התוצאות; עם זאת, פורמט הדו-מיוד שלהם מאבד באופן בלתי נמנע מידע דינמי. מחקרים אחרונים התמקדו בהתפרזרות (כלומר, התנועה של תאים ממחזור לתוך רקמה, כגון מחסום מוח הדם) בסביבה 3D14,15. המרחק ההתרבזרות לתוך רקמה והתנהגות בדיקה המתרחשת במחסום התא / קרום הוא מעודן יותר מאשר מדידות שנאספו באמצעות תא Boyden או מכשיר הגירה מיקרופלויד 2D16. לפיכך, התקנים המאפשרים הדמיה וניתוח מתאימים של 3D מתפשטים הם קריטיים כדי ללכוד מדידות מתוחכמות אלה, אך חסרים בספרות.
ללא תלות בהדמיית הגירה, פותחו טכניקות הדמיה חזקות להדמיית תהודה מגנטית (MRI) וטומוגרפיה שמצליחות לזהות ולחזר במדויק רקמות בחלל תלת-ממדי17,,18. טכניקות אלה לרכוש תמונות z-stacks וחלקים קטע של התמונה בהתבסס על המאפיינים של הרקמה ולאחר מכן להמיר את התמונות מחולקות לתוך רשתות תלתממדיות 19,20,21. זה מאפשר לרופאים לדמיין באיברים, עצמות, וכלי דם בודדים 3D כדי לסייע בתכנון כירורגי או סיוע באבחון של סרטן או מחלותלב 22,23. כאן, נראה כי גישות אלה ניתן להתאים לשימוש על דגימות מיקרוסקופיות והתקני אקסטרפולציה 3D.
בסוף זה פיתחנו את טכניקת טומוגרפיה קונפוקלית חדשנית, המוצגת במסמך זה, אשר מאפשרת גמישות ללמוד את ההתופפות של תאים סרטניים על פני קרום על ידי התאמת כלי טומוגרפיה קיימים. גישה זו מאפשרת לחקור את מגוון רחב של התנהגויות תאים סרטניים כפי שהם אינטראקציה עם מחסום תאי, כגון שכבת תא אנדותל. תאים סרטניים להפגין התנהגויות לחקר; חלקם עלולים לפלוש אך להישאר קרובים לממברנה, בעוד שאחרים חוצים את המחסום בקלות. טכניקה זו מסוגלת להניב מידע על הפנוטיפ של התא בכל הממדים24. שימוש בגישה זו כדי ללמוד את TME הוא גם זול יחסית, קל לפרש, ו לשכפל, בהשוואה מורכב יותר במודלים מורין vivo. המתודולוגיה המוצגת צריכה לספק בסיס חזק למחקר של סוגים רבים של גידולים וסביבות מיקרו על ידי התאמת אזור סטרומה.
אנו מתארים ומדגימים את השימוש בפלטפורמת נישת דם מיקרו-נוזלית תלת-מיתד (μmBBN)(איור 1)שבה אלמנטים קריטיים של המחסום והנישה (תאי אנדותל מיקווסקול במוח ואסטרוציטים) יכולים להיות תרבותיים לתקופה ממושכת (כ-9 ימים), פלואורסצנטית התמונה על ידי מיקרוסקופית confocal, והתמונות ששוחזרו באמצעות טכניקת טומוגרפיה קונקודלית שלנו (איור 2); כל שמטרתו להבין את הפיתוח של מיקרו גרורות ושינויים בסביבת מיקרו הגידול באופן חוזר וכמותי. ממשק מחסום הדם עם נישת המוח מורכב תאי אנדותל microvascular במוח כי הם מחוזקים על ידי קרום מרתף, רגלי אסטרוציטים, pericytes25. התמקדנו באופן סלקטיבי ברכיבים אסטרוציט אנדותל בהתחשב בחשיבותם בהקמה ורגולציה של מחסום מוח הדם. אנו מדגימים כיצד לפברק, זרע, תמונה, ולנתח את התאים הסרטניים ואת הגידול מיקרו סביבה רכיבים תאיים והומוריסטיים, באמצעות פלטפורמה זו. לבסוף, אנו מראים כיצד ניתן להשתמש בלמידת מכונה כדי לזהות את ההבדלים הפנוטיים הפנימיים של תאים סרטניים המסוגלים לעבור דרך מודל μmBBN ולהקצות להם אינדקס אובייקטיבי של פוטנציאלגרורתי במוח 24. ניתן להשתמש ב ערכות הנתונים שנוצרו על ידי שיטה זו כדי לענות על שאלות בסיסיות ותרגום על גרורות, אסטרטגיות טיפוליות, ואת התפקיד של TME בשניהם.
Protocol
Representative Results
Discussion
פיתחנו והציגנו שיטה חדשה המתאימה כלים מנוצלים לעתים קרובות בניתוחי הדמיה קלינית למדידת אקסטרווסטרציה והגירה של תאים סרטניים באמצעות מחסום אנדותל לתוך רקמת המוח. אנו מציבים גישה זו יכולה להיות שימושית הן בvio והן במדידות במבחנה; הוכחנו את השימוש בו על מערכת מיקרו-נוזלית תלת-מיודמת המשנה את…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים למעבדת סטיג, במכון הלאומי לסרטן על תרומתם הנדיבה של תאי MDA-MB-231-BR-GFP. מיקרוסקופית Confocal בוצע המכון הביו-פנים של אוניברסיטת מישיגן (BI). ציתימטריית זרימה בוצעה באוניברסיטת מישיגן זרימה Cytometry Core. וקטורים ויראליים נוצרו על ידי אוניברסיטת מישיגן וקטור Core. אנו גם מודים לקלי קידוול על ההדרכה בניתוח סטטיסטי של נתונים אלה.
מימון:
C.R.O. נתמך חלקית על ידי מלגת הדרכה NIH T-32 (T32CA009676) ו 1R21CA245597-01. T.M.W. נתמך חלקית על ידי 1R21CA245597-01 והמרכז הלאומי לקידום מדעי התרגום של המכונים הלאומיים לבריאות תחת פרס מספר UL1TR002240. מימון חומרים ואפיון סופק על ידי המכון הלאומי לסרטן של המכונים הלאומיים לבריאות תחת פרס מספר 1R21CA245597-01, P30CA046592, 5T32CA009676-23, CA196018, AI116482, קרן METAvivor, והקרן לחקר סרטן השד. התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים ואינו מייצג בהכרח את השקפותיהם הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA with phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| 1.5 mm biopsy punch with plunger | Integra LifeSciences Corporation | 33-31A-P/25 | |
| 10x MEM | Thermo Fisher Scientific | 11430030 | |
| 150 mm petri dishes | Fisher Scientific | FB0875714 | |
| 1x DPBS, without Ca and Mg | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
| 200uL pipette tip | Fisher Scientific | 02-707-411 | |
| 4 inch silicon wafer | University Wafer | 452 | |
| 48 mm wide packing tape | Fisher Scientific | 19-072-097 | |
| 50 x 75 mm glass slide | Fisher Scientific | 12-550C | |
| A1 confocal microscope | Nikon | ||
| acetone | Fisher Scientific | A9-20 | |
| antibiotic/antimycotic (penicillin/streptomycin/amphotericin) | Gibco | 15240062 | |
| box cutter blade | Fisher Scientific | NC1721575 | |
| dissection scissors | Fisher Scientific | 08-951-5 | |
| DMEM with 4.5 g/L glucose | Thermo Fisher Scientific | 11960-044 | |
| double sided tape | Fisher Scientific | NC0879005 | |
| EGM-2 | Lonza | CC-3162 | |
| Fetal Bovine Serum, Heat inactivated | Corning | MT35011CV | |
| Fiji software | ImageJ | ||
| glass vial | Fisher Scientific | 03-341-25D | |
| glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| hCMEC/D3 | EMD Millipore | SCC066 | |
| Jupyter notebook | Anaconda | ||
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| Matrigel – growth factor reduced with phenol red | Corning | CB-40230A | |
| MDA-MB-231 | ATCC | HTB-26 | |
| MDA-MB-231-BR-GFP | Dr. Patricia Steeg, NIH | ||
| N-2 growth supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| normal human astrocytes (NHA) | Lonza | CC-2565 | |
| Orange software | University of Ljubljana | ||
| Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-711-9AM | |
| Photolithography masks | Photosciences Incorporated | ||
| pLL3.7-dsRed | University of Michigan Vector Core | ||
| pLL-EV-GFP | University of Michigan Vector Core | ||
| pLOX-TERT-iresTK | Addgene | 12245 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| polycarbonate membrane, 5um pore size | Millipore | TMTP04700 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| PureCol, 3 mg/mL | Advanced Biomatrix | 5005 | Type I bovine collagen |
| sodium bicarbonate | Thermo Fisher Scientific | 25080094 | |
| sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | |
| Solo cup | Fisher Scientific | NC1416545 | |
| SU-8 2075 | MicroChem Corporation | Y111074 0500L1GL | |
| SU8 developer | MicroChem Corporation | Y020100 4000L1PE | |
| Sylgard 184 | Ellsworth Adhesive Company | NC0162601 | |
| Toluene | Sigma-Aldrich | 179965-1L | |
| Tricholoro perfluoro octyl silane | Sigma-Aldrich | 448931-10G |
References
- Rastogi, K., et al. Palliation of Brain Metastases: Analysis of Prognostic Factors Affecting Overall Survival. Indian Journal of Palliative Care. 24 (3), 308-312 (2018).
- Wang, R., et al. The Clinicopathological features and survival outcomes of patients with different metastatic sites in stage IV breast cancer. BMC Cancer. 19 (1), 1091 (2019).
- Valster, A., et al. Cell migration and invasion assays. Methods. 37 (2), 208-215 (2005).
- Eccles, S. A., Box, C., Court, W. Cell migration/invasion assays and their application in cancer drug discovery. Biotechnology Annual Review. 11, 391-421 (2005).
- Brekhman, V., Neufeld, G. A novel asymmetric 3D in-vitro assay for the study of tumor cell invasion. BMC Cancer. 9, 415 (2009).
- Chen, H. C. Boyden chamber assay. Methods in Molecular Biology. 294, 15-22 (2005).
- Poissonnier, A., Legembre, P. Boyden Chamber Assay to Study of Cell Migration Induced by Metalloprotease Cleaved-CD95L. Methods in Molecular Biology. 1557, 117-123 (2017).
- Li, X., Yang, H., Huang, H., Zhu, T. CELLCOUNTER: novel open-source software for counting cell migration and invasion in vitro. BioMed Research International. 2014, 863564 (2014).
- Little, A. C., et al. IL-4/IL-13 Stimulated Macrophages Enhance Breast Cancer Invasion Via Rho-GTPase Regulation of Synergistic VEGF/CCL-18 Signaling. Frontiers in Oncology. 9, 456 (2019).
- Allen, S. G., et al. Macrophages Enhance Migration in Inflammatory Breast Cancer Cells via RhoC GTPase Signaling. Scientific Reports. 6, 39190 (2016).
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Chen, Y. C., et al. Single-cell Migration Chip for Chemotaxis-based Microfluidic Selection of Heterogeneous Cell Populations. Scientific Reports. 5, 9980 (2015).
- Choi, Y. P., et al. Cancer-associated fibroblast promote transmigration through endothelial brain cells in three-dimensional in vitro models. International Journal of Cancer. 135 (9), 2024-2033 (2014).
- Takeshita, Y., et al. An in vitro blood-brain barrier model combining shear stress and endothelial cell/astrocyte co-culture. Journal of Neuroscience Methods. 232, 165-172 (2014).
- Kienast, Y., et al. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nature Medicine. 16 (1), 116-122 (2010).
- Schroeder, W., Martin, K., Lorenson, B. . The Visualization Toolkit. 4th edn. , (2006).
- Wells, W. M., Grimson, W. L., Kikinis, R., Jolesz, F. A. Adaptive segmentation of MRI data. IEEE Transactions on Medical Imaging. 15 (4), 429-442 (1996).
- Agarwal, S. K., Singh, S., Ghuman, S. S., Sharma, S., Lahiri, A. K. Radiological assessment of the Indian children with congenital sensorineural hearing loss. International Journal of Otolaryngology. 2014, 808759 (2014).
- Mansfield, P., Maudsley, A. A. Medical imaging by NMR. The British Journal of Radiology. 50 (591), 188-194 (1977).
- Plewes, D. B., Kucharczyk, W. Physics of MRI: a primer. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 35 (5), 1038-1054 (2012).
- Batteux, C., Haidar, M. A., Bonnet, D. 3D-Printed Models for Surgical Planning in Complex Congenital Heart Diseases: A Systematic Review. Frontiers in Pediatrics. 7, 23 (2019).
- Thibault, F., et al. MRI for surgical planning in patients with breast cancer who undergo preoperative chemotherapy. American Journal of Roentgenology. 183 (4), 1159-1168 (2004).
- Oliver, C. R., et al. A platform for artificial intelligence based identification of the extravasation potential of cancer cells into the brain metastatic niche. Lab on a Chip. 19 (7), 1162-1173 (2019).
- Gril, B., et al. Reactive astrocytic S1P3 signaling modulates the blood-tumor barrier in brain metastases. Nature Communications. 9 (1), 2705 (2018).
- Badilescu, S., Packirisamy, M. . BioMEMS: Science And Engineering Perspectives. , (2011).
- Liu, C. . Foundations of MEMS. 2nd edn. , (2012).
- Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (muBBB). Lab on a Chip. 12 (10), 1784-1792 (2012).
- Lockman, P. R., et al. Heterogeneous blood-tumor barrier permeability determines drug efficacy in experimental brain metastases of breast cancer. Clinical Cancer Research. 16 (23), 5664-5678 (2010).
- Ryan Oliver, C., W, T. M. Con-tom: A Jupyter Notebook for Analyzing the tumor micro-environment in confocal images. Zenodo. , (2020).
- Lorensen, W. E., Johnson, C., Kasik, D., Whitton, M. C. History of the Marching Cubes Algorithm. IEEE Computer Graphics and Applications. 40 (2), 8-15 (2020).
- Kleinbaum, D. G., Kupper, L. L. . Applied regression analysis and other multivariable methods. , (1978).
- Berg, M. d. . Computational geometry : algorithms and applications, 2nd rev. edn. , (2000).
- Esch, M. B., Post, D. J., Shuler, M. L., Stokol, T. Characterization of in vitro endothelial linings grown within microfluidic channels. Tissue Engineering Part A. 17 (23-24), 2965-2971 (2011).
- Brinkley, B. R., et al. Variations in cell form and cytoskeleton in human breast carcinoma cells in vitro. 암 연구학. 40 (9), 3118-3129 (1980).
- Eigenmann, D. E., et al. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids and Barriers of the Central Nervous System. 10 (1), 33 (2013).
- Griep, L. M., et al. BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomedical Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).
- Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids and Barriers of the Central Nervous System. 10 (1), 16 (2013).
- Dello Russo, C., et al. The human microglial HMC3 cell line: where do we stand? A systematic literature review. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 259 (2018).
- Dun, M. D., et al. Proteotranscriptomic Profiling of 231-BR Breast Cancer Cells: Identification of Potential Biomarkers and Therapeutic Targets for Brain Metastasis. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (9), 2316-2330 (2015).
- Xing, F., et al. Reactive astrocytes promote the metastatic growth of breast cancer stem-like cells by activating Notch signalling in brain. EMBO Molecular Medicine. 5 (3), 384-396 (2013).
- Zhang, B., Radisic, M. Organ-on-a-chip devices advance to market. Lab on a Chip. 17 (14), 2395-2420 (2017).
