Quantificare il micro-ambiente del tumore metastatico del cervello utilizzando un modello 3D a chip Organ-On-A, apprendimento automatico e tomografia confocale
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per preparare e cultare una barriera ematica del micro-ambiente tumorale metastatico e quindi quantificare il suo stato utilizzando l’imaging confocale e l’intelligenza artificiale (apprendimento automatico).
Abstract
Le metastasi cerebrali sono le lesioni tumorali più letali; 10-30% di tutti i tumori metastasi al cervello, con una sopravvivenza mediana di soli 5-20 mesi, a seconda del tipo di cancro. Per ridurre il carico del tumore metastatico del cervello, le lacune nella conoscenza di base e traslazione devono essere affrontate. Le sfide principali includono una scarsità di modelli preclinici riproducibili e strumenti associati. I modelli tridimensionali della metastasi cerebrale possono produrre i dati molecolari e fenotipi pertinenti utilizzati per affrontare queste esigenze quando combinati con strumenti di analisi dedicati. Inoltre, rispetto ai modelli murini, i modelli organo su chip delle cellule tumorali del paziente che attraversano la barriera ematica nel microambiente cerebrale generano risultati rapidamente e sono più interpretabili con metodi quantitativi, quindi suscettibili a test ad alta produttività. Qui descriviamo e dimostriamo l’uso di una nuova piattaforma di nicchia microfluidica del cervello del sangue 3D (mBBN) in cui più elementi della nicchia possono essere ricostrutti per un periodo prolungato (diversi giorni), fluorescently immagine da microscopia confocale, e le immagini ricostruite utilizzando un’innovativa tecnica di tomografia confocale; tutti miravano a comprendere lo sviluppo di micro-metastasi e i cambiamenti al micro-ambiente tumorale (TME) in modo ripetibile e quantitativo. Dimostriamo come fabbricare, seminare, immagine e analizzare le cellule tumorali e i componenti cellulari e umoristici TME, utilizzando questa piattaforma. Inoltre, mostriamo come l’intelligenza artificiale (AI) viene utilizzata per identificare le differenze fenotipici intrinseche delle cellule tumorali che sono in grado di transitare attraverso un modello di mBBN e per assegnare loro un indice oggettivo del potenziale metastatico cerebrale. I set di dati generati da questo metodo possono essere utilizzati per rispondere a domande di base e trasfondiali sulla metastasi, sull’efficacia delle strategie terapeutiche e sul ruolo del TME in entrambi.
Introduction
Le metastasi cerebrali sono le lesioni tumorali più letali; 10-30% di tutti i tumori metastasi al cervello, con una sopravvivenza mediana di soli 5-20 mesi, a seconda del tipo dicancro 1,2. Una domanda principale che si pone quando si studia la metastasi del cancro è come i sub cloni migrano dall’ambiente umoristico del flusso sanguigno in un organocome il cervello 3,4. Questa domanda ha portato a molte variazioni di analisi di migrazione, invasione e stravasazione. Tutti questi metodi condividono la fase critica del conteggio o della misurazione delle proprietà delle cellule che si spostano da una posizione all’altra in risposta a uno stimolo. La maggior parte dei saggi migratori prontamente disponibili sono utilizzati per studiare la migrazione bidimensionale (2D) delle cellule tumorali. Questi hanno chiarito una ricchezza di conoscenza; tuttavia, non ricapitolano la natura tridimensionale del sistema in vivo che altri metodi possono fornire5. Pertanto, è necessario studiare il micro-ambiente tumorale (TME) in sistemi tridimensionali (3D), ma gli approcci di analisi disponibili per le strutture 3D sono limitati e spesso incoerenti.
Uno degli strumenti 3D più popolari è una camera Boyden che consiste in una membrana sospesa nella parte inferiore di un pozzo, che separa due regioni distinte. Boyden ha introdotto il saggio per studiare la chemiocita leucocato4. Le regioni inferiori possono essere variate in base alla chimica o ad altrimezzi 6,7 per indurre le cellule nella regione superiore a migrare nella regione inferiore. L’approccio più comune per quantificare il numero di cellule migrate è quello di rilasciare le cellule dal fondo della membrana utilizzando una soluzione tampone, li lyse, e quindi contarli in base alla quantità di contenuto di DNA nella soluzione7. Questo approccio indiretto è soggetto a errori dell’operatore a causa della variabilità tecnica e la procedura distrugge le informazioni sul fenotipo del cancro e sul micro-ambiente. Variazioni del saggio camera Boyden comportano fissazione delle cellule migratorie che rimangono sulla membrana, ma fornisce solo un conteggio delle cellule che non sono più praticabili per lo studiocontinuo 6,8,9.
A causa dei limiti della camera Boyden e della crescita delle innovazioni nella comunità microfluidica, sono stati sviluppati chip di analisi della migrazione che osservano il movimento delle cellule in risposta a uno stimolo in una direzione piuttosto che intre 10,11,12. Questi saggi di migrazione facilitano il controllo su fattori quali il flusso o la separazione di singolecellule 13,14 che consentono una migliore interpretazione dei risultati; tuttavia, il loro formato 2D perde inevitabilmente alcune informazioni dinamiche. Recenti studi si sono concentrati sulla stravasazione (cioè il movimento delle cellule dalla circolazione in un tessuto, come la barriera ematica) in un ambiente 3D14,15. La distanza di stravasazione nel comportamento di tessuto e sonda che si verifica alla barriera/membrana cellulare è più raffinata rispetto alle misurazioni raccolte utilizzando la camera Boyden o un dispositivo di migrazione microfluidico 2D16. Pertanto, i dispositivi che consentono un’adeguata imaging e analisi della stravasazione 3D sono fondamentali per catturare queste misurazioni sofisticate, ma sono carenti nella letteratura.
Indipendentemente dai saggi di migrazione, sono state sviluppate robuste tecniche di imaging per la risonanza magnetica (RSI) e la tomografia che sono in grado di identificare e ricostruire con precisione il tessuto nello spazio 3D17,18. Queste tecniche acquisiscono immagini in z-stack e parti di segmento dell’immagine in base alle proprietà del tessuto e quindi convertono le immagini segmentate in mesh tridimensionali19,20,21. Questo permette ai medici di visualizzare in 3D singoli organi, ossa e vasi per aiutare nella pianificazione chirurgica o nell’aiuto nella diagnosi di cancro o malattiecardiache 22,23. Qui, mostreremo che questi approcci possono essere adattati per l’uso su campioni microscopici e dispositivi di stravasazione 3D.
A fine questo, abbiamo sviluppato l’innovativa tecnica di tomografia confocale, presentata qui, che offre flessibilità per studiare la stravasazione delle cellule tumorali attraverso una membrana adattando gli strumenti di tomografia esistenti. Questo approccio consente lo studio dell’intera gamma dei comportamenti delle cellule tumorali mentre interagiscono con una barriera cellulare, come uno strato cellulare endoteliale. Le cellule tumorali presentano comportamenti di sondaggio; alcuni possono invadere ma rimanere vicino alla membrana, mentre altri attraversano facilmente la barriera. Questa tecnica è in grado di produrre informazioni sul fenotipo della cellula in tutte le dimensioni24. L’utilizzo di questo approccio per studiare il TME è relativamente economico, facile da interpretare e riproducibile, rispetto ai modelli murine in vivo più complessi. La metodologia presentata dovrebbe fornire una solida base per lo studio di molti tipi di tumori e micro-ambienti adattando la regione stromica.
Descriviamo e dimostriamo l’uso di una piattaforma 3D di nicchia del cervello del sangue microfluidica(Figura 1)in cui gli elementi critici della barriera e della nicchia (cellule endoteliali microvascolari cerebrali e astrociti) possono essere ristrutturati per un periodo prolungato (circa fino a 9 giorni), fluorescentemente immagini dalla microscopia confocale, e le immagini ricostruite utilizzando la nostra tecnica tomografia confocale (Figura 2); tutti miravano a comprendere lo sviluppo di micro-metastasi e i cambiamenti nel micro-ambiente tumorale in modo ripetibile e quantitativo. L’interfaccia della barriera ematica con la nicchia cerebrale è composta da cellule endoteliali microvascolari cerebrali che sono rafforzate da membrana seminterrato, piedi astrociti e periciti25. Ci siamo concentrati selettivamente sui componenti astrociti ed endoteliali data la loro importanza nella formazione e nella regolazione della barriera ematica. Dimostriamo come fabbricare, seminare, immagine e analizzare le cellule tumorali e i componenti cellulari e umoristici del micro-ambiente tumorale, utilizzando questa piattaforma. Infine, mostriamo come l’apprendimento automatico possa essere utilizzato per identificare le differenze fenotipici intrinseche delle cellule tumorali che sono in grado di transitare attraverso un modello di mBBN e per assegnare loro un indice oggettivo del potenziale metastatico cerebrale24. I set di dati generati da questo metodo possono essere utilizzati per rispondere a domande di base e trasslezionali sulla metastasi, sulle strategie terapeutiche e sul ruolo del TME in entrambi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Abbiamo sviluppato e presentato un nuovo metodo che adatta gli strumenti spesso utilizzati nelle analisi di imaging clinico per la misurazione della stravasazione e la migrazione delle cellule tumorali attraverso una barriera endoteliale nel tessuto cerebrale. Pongono questo approccio può essere utile sia per le misurazioni in vivo che in vitro; abbiamo dimostrato il suo uso su un sistema microfluidico 3D che ricapitola la vascolatura cerebrale. Le misurazioni delle cellule tumorali, tra cui la distanza stravasata, la p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo lo Steeg Lab, del National Cancer Institute per la generosa donazione di cellule MDA-MB-231-BR-GFP. La microscopia confocale è stata eseguita presso l’Istituto Biointerfaces dell’Università del Michigan (BI). La citometria del flusso è stata eseguita presso l’University of Michigan Flow Cytometry Core. I vettori virali sono stati creati dall’Università del Michigan Vector Core. Ringraziamo anche Kelley Kidwell per la guida nell’analisi statistica di questi dati.
Finanziamento:
C.R.O. è stato parzialmente supportato da una NIH T-32 Training Fellowship (T32CA009676) e 1R21CA245597-01. T.M.W. è stato parzialmente supportato da 1R21CA245597-01 e dal National Center for Advancing Translational Sciences del National Institutes of Health sotto il numero premio UL1TR002240. Il finanziamento per i materiali e la caratterizzazione è stato fornito dal National Cancer Institute of the National Institutes of Health con il numero premio 1R21CA24597-01, P30CA046592, 5T32CA009676-23, CA196018, AI116482, METAvivor Foundation e la Breast Cancer Research Foundation. Il contenuto è esclusivamente di competenza degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali dei National Institutes of Health
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA with phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| 1.5 mm biopsy punch with plunger | Integra LifeSciences Corporation | 33-31A-P/25 | |
| 10x MEM | Thermo Fisher Scientific | 11430030 | |
| 150 mm petri dishes | Fisher Scientific | FB0875714 | |
| 1x DPBS, without Ca and Mg | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
| 200uL pipette tip | Fisher Scientific | 02-707-411 | |
| 4 inch silicon wafer | University Wafer | 452 | |
| 48 mm wide packing tape | Fisher Scientific | 19-072-097 | |
| 50 x 75 mm glass slide | Fisher Scientific | 12-550C | |
| A1 confocal microscope | Nikon | ||
| acetone | Fisher Scientific | A9-20 | |
| antibiotic/antimycotic (penicillin/streptomycin/amphotericin) | Gibco | 15240062 | |
| box cutter blade | Fisher Scientific | NC1721575 | |
| dissection scissors | Fisher Scientific | 08-951-5 | |
| DMEM with 4.5 g/L glucose | Thermo Fisher Scientific | 11960-044 | |
| double sided tape | Fisher Scientific | NC0879005 | |
| EGM-2 | Lonza | CC-3162 | |
| Fetal Bovine Serum, Heat inactivated | Corning | MT35011CV | |
| Fiji software | ImageJ | ||
| glass vial | Fisher Scientific | 03-341-25D | |
| glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| hCMEC/D3 | EMD Millipore | SCC066 | |
| Jupyter notebook | Anaconda | ||
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| Matrigel – growth factor reduced with phenol red | Corning | CB-40230A | |
| MDA-MB-231 | ATCC | HTB-26 | |
| MDA-MB-231-BR-GFP | Dr. Patricia Steeg, NIH | ||
| N-2 growth supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| normal human astrocytes (NHA) | Lonza | CC-2565 | |
| Orange software | University of Ljubljana | ||
| Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-711-9AM | |
| Photolithography masks | Photosciences Incorporated | ||
| pLL3.7-dsRed | University of Michigan Vector Core | ||
| pLL-EV-GFP | University of Michigan Vector Core | ||
| pLOX-TERT-iresTK | Addgene | 12245 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| polycarbonate membrane, 5um pore size | Millipore | TMTP04700 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| PureCol, 3 mg/mL | Advanced Biomatrix | 5005 | Type I bovine collagen |
| sodium bicarbonate | Thermo Fisher Scientific | 25080094 | |
| sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | |
| Solo cup | Fisher Scientific | NC1416545 | |
| SU-8 2075 | MicroChem Corporation | Y111074 0500L1GL | |
| SU8 developer | MicroChem Corporation | Y020100 4000L1PE | |
| Sylgard 184 | Ellsworth Adhesive Company | NC0162601 | |
| Toluene | Sigma-Aldrich | 179965-1L | |
| Tricholoro perfluoro octyl silane | Sigma-Aldrich | 448931-10G |
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