Kvantifisere hjernen metastatisk tumor mikro-miljø ved hjelp av en organ-on-a chip 3D modell, maskinlæring, og konfokal tomografi

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å forberede og kultivere en blod hjernebarriere metastatisk tumor mikro-miljø og deretter kvantifisere sin tilstand ved hjelp av konfokal avbildning og kunstig intelligens (maskinlæring).

Abstract

Hjernemetastaser er de mest dødelige kreftlesjonene; 10-30% av alle kreftformer metastaserer til hjernen, med en median overlevelse på bare ~ 5-20 måneder, avhengig av krefttypen. For å redusere hjernens metastatiske tumorbyrde må hull i grunnleggende og translasjonell kunnskap tas opp. Store utfordringer inkluderer en mangel på reproduserbare prekliniske modeller og tilhørende verktøy. Tredimensjonale modeller av hjernemetastase kan gi de relevante molekylære og fenotypiske dataene som brukes til å møte disse behovene når de kombineres med dedikerte analyseverktøy. Videre, sammenlignet med murine modeller, organ-on-a-chip modeller av pasient tumorceller traversering blod hjernebarrieren inn i hjernen mikromiljø generere resultater raskt og er mer tolkes med kvantitative metoder, og dermed mottagelig for høy gjennomstrømning testing. Her beskriver og demonstrerer vi bruken av en ny 3D mikrofluidisk blod hjerne nisje (μmBBN) plattform hvor flere elementer av nisje kan dyrkes i en lengre periode (flere dager), fluorescerende avbildet av konfokal mikroskopi, og bildene rekonstruert ved hjelp av en innovativ konfokaltomografi teknikk; alle hadde som mål å forstå utviklingen av mikrometastase og endringer i tumormikromiljøet (TME) på en repeterbar og kvantitativ måte. Vi demonstrerer hvordan vi kan dikte, frø, bilde og analysere kreftcellene og TME cellulære og humorale komponenter, ved hjelp av denne plattformen. Videre viser vi hvordan kunstig intelligens (AI) brukes til å identifisere de iboende fenotypiske forskjellene i kreftceller som er i stand til transitt gjennom en modell μmBBN og for å tildele dem en objektiv indeks av hjernenmetastatisk potensial. Datasettene som genereres av denne metoden, kan brukes til å svare på grunnleggende og translasjonelle spørsmål om metastase, effekten av terapeutiske strategier og TME-ens rolle i begge.

Introduction

Hjernemetastaser er de mest dødelige kreftlesjonene; 10-30% av alle kreftformer metastaserer til hjernen, med en median overlevelse på bare ~ 5-20 måneder, avhengig av kreft type^1,2. Et hovedspørsmål som oppstår når man studerer kreftmetastase er hvordan subkloner migrerer fra blodets humorale miljø til et organ som hjernen^3,4. Dette spørsmålet har ført til mange variasjoner av migrasjon, invasjon og ekstravasasjonsanalyser. Alle disse metodene deler det kritiske trinnet for å telle eller måle egenskaper for celler som beveger seg fra ett sted til et annet som svar på en stimulans. De fleste migrasjonsanalyser som er lett tilgjengelige, brukes til å studere todimensjonal (2D) migrering av kreftceller. Disse har belyst et vell av kunnskap; Imidlertid rekafulerer de ikke den tredimensjonale naturen til in vivo-systemet som andre metoder kan gi⁵. Derfor er det nødvendig å studere tumormikromiljøet (TME) i tredimensjonale (3D) systemer, men analysetilnærmingene som er tilgjengelige for 3D-strukturer er begrensede og ofte inkonsekvente.

Et av de mest populære 3D-verktøyene er et Boyden-kammer som består av en membran suspendert på bunnen av en brønn, som skiller to forskjellige regioner. Boyden introduserte analysen for å studere leukocytt chemotaxis⁴. De nederste områdene kan varieres av kjemi eller andre^{midler 6,7} for å indusere celler i det øvre området for å migrere til det nedre området. Den vanligste tilnærmingen til å kvantifisere antall celler som har migrert er å frigjøre cellene fra bunnen av membranen ved hjelp av en bufferløsning, lyse dem, og deretter telle dem basert på mengden DNA-innhold i løsningen⁷. Denne indirekte tilnærmingen er utsatt for operatørfeil på grunn av teknikkvariabilitet, og prosedyren ødelegger informasjon om kreftfenotypen og mikromiljøet. Variasjoner av Boyden kammeranalyse innebærer fiksering av trekkceller som forblir på membranen, men gir bare et antall celler som ikke lenger er levedyktige for fortsatt studie^6,8,9.

På grunn av begrensninger av Boyden kammeret og veksten av innovasjoner i mikrofluidisk samfunnet, migrasjon analyse chips har blitt utviklet som observerer bevegelsen av celler som svar på en stimulans i en retning i stedet for^{tre 10,11,12}. Disse overføringsanalysene legger til rette for kontroll over faktorer som flyt eller enkeltcelleseparasjon^13,14 som muliggjør bedre tolkning av resultatene; Imidlertid mister deres 2D-format uunngåelig noe dynamisk informasjon. Nyere studier har fokusert på ekstravasasjon (det vil vil vil at bevegelsen av celler fra sirkulasjon til et vev, for eksempel blodhjernebarrieren) i et 3D-miljø^14,15. Den ekstravasasjonsavstanden i vev og sonderingsatferd som oppstår ved cellulær barriere/membran er mer raffinert enn målinger som er hentet ved hjelp av enten Boyden-kammeret eller en 2D mikrofluidisk migrasjonsenhet¹⁶. Dermed er enheter som muliggjør passende bildebehandling og analyse av 3D-ekstravasasjon avgjørende for å fange opp disse sofistikerte målingene, men mangler i litteraturen.

Uavhengig av migrasjonsanalyser er robuste bildeteknikker utviklet for magnetisk resonansavbildning (MR) og tomografi som er i stand til å identifisere og nøyaktig rekonstruere vev i 3D-rom^17,,18. Disse teknikkene skaffe bilder i z-stabler og segment deler av bildet basert på egenskapene til vevet og deretter konvertere segmenterte bilder til tredimensjonale masker^19,,20,,21. Dette gjør det mulig for leger å visualisere i 3D individuelle organer, bein og fartøy for å hjelpe til med kirurgisk planlegging eller hjelp til diagnostisering av kreft eller hjertesykdom^22,23. Her vil vi vise at disse tilnærmingene kan tilpasses for bruk på mikroskopiske prøver og 3D-ekstravasasjonsenheter.

For dette formål utviklet vi den innovative confocal tomografiteknikken, presentert her, som gir fleksibilitet til å studere ekstravasasjon av tumorceller over en membran ved å tilpasse eksisterende tomografiverktøy. Denne tilnærmingen gjør det mulig å studere hele spekteret av kreftcelleatferd når de samhandler med en cellulær barriere, for eksempel et endotelcellelag. Kreftceller viser sondering atferd; noen kan invadere, men forbli nær membranen, mens andre krysser barrieren lett. Denne teknikken er i stand til å gi informasjon om fenotypen av cellen i alle dimensjoner²⁴. Ved hjelp av denne tilnærmingen til å studere TME er både relativt billig, lett å tolke og reproduserbar, sammenlignet med mer komplekse in vivo murine modeller. Den presenterte metodikken bør gi et sterkt grunnlag for studiet av mange typer svulster og mikromiljøer ved å tilpasse stromalregionen.

Vi beskriver og demonstrerer bruken av en 3D mikrofluidisk blod hjerne nisje (μmBBN) plattform (Figur 1) hvor kritiske elementer av barrieren og nisje (hjernen mikrovaskulære endotelceller og astrocytter) kan dyrkes i en lengre periode (ca. 9 dager), fluorescerende avbildet av konfokal mikroskopi, og bildene rekonstruert ved hjelp av vår confocal tomografi teknikk (Figur 2); alle hadde som mål å forstå utviklingen av mikrometastase og endringer i tumormikromiljøet på en repeterbar og kvantitativ måte. Blod hjernebarrieren grensesnitt med hjernen nisje består av hjernen mikrovaskulære endotelceller som er styrket av kjellermembran, astrocytt føtter, og pericytes²⁵. Vi fokuserte selektivt på astrocytten og endotelkomponentene gitt deres betydning i dannelsen og reguleringen av blodhjernebarrieren. Vi demonstrerer hvordan vi kan fremstille, frø, bilde og analysere kreftceller og tumor mikro-miljø cellulære og humorale komponenter, ved hjelp av denne plattformen. Til slutt viser vi hvordan maskinlæring kan brukes til å identifisere de iboende fenotypiske forskjellene i kreftceller som er i stand til transitt gjennom en modell μmBBN og å tildele dem en objektiv indeks av hjernens metastatiske^{potensial 24}. Datasettene som genereres av denne metoden, kan brukes til å svare på grunnleggende og translasjonelle spørsmål om metastase, terapeutiske strategier og TME-rollen i begge.

Protocol

1. Forbered blod hjernebarrieren nisje mold MERK: Den kulterende enheten som brukes i denne plattformen er et PDMS-basert stillas som vi bygger en cellulær blodhjernebarriere nisje på. Den er laget av to deler adskilt av en porøs membran. For å forberede blod hjernebarrieren nisje to SU-8 former laget ved hjelp av fotolitografi er nødvendig26,27. Protokollen vil bli beskrevet for 100 μm tykk form først og deretter notater vil bli …

Representative Results

Ved hjelp av denne teknikken analyserte vi celletyper merket med forskjellige fluorescerende proteiner eller fargestoffer. Vi demonstrerer bruken av denne tilnærmingen med en μmBBN-chip formulert med hCMEC/D3-DsRed og ikke-fluorescerende astrocytter. Hjernen mikrovaskulære endotelceller ble seeded på en porøs membran (5 μm spor etset porer) og plassert i en inkubator34 ved 37 ° C under 5% CO2. Etter tre dager ble samløpet av endeotellaget bekreftet via mikroskopi, og deretter bl…

Discussion

Vi har utviklet og presentert en ny metode som tilpasser verktøy som ofte benyttes i kliniske bildeanalyser for måling av ekstravasasjon og migrering av kreftceller gjennom en endotelbarriere til hjernevev. Vi utgjør denne tilnærmingen kan være nyttig for både in vivo og in vitro målinger; vi har vist sin bruk på et 3D mikrofluidisk system rekafilaterende hjernevaskulatur. Kreftcellemålinger, inkludert avstandsavsatt, prosent ekstravasert av volum, sfærisitet og volum kvantifiseres ved hjelp av denne teknikken….

Materials

0.25% Trypsin-EDTA with phenol red	Thermo Fisher Scientific	25200056
1.5 mm biopsy punch with plunger	Integra LifeSciences Corporation	33-31A-P/25
10x MEM	Thermo Fisher Scientific	11430030
150 mm petri dishes	Fisher Scientific	FB0875714
1x DPBS, without Ca and Mg	Thermo Fisher Scientific	14190144
200uL pipette tip	Fisher Scientific	02-707-411
4 inch silicon wafer	University Wafer	452
48 mm wide packing tape	Fisher Scientific	19-072-097
50 x 75 mm glass slide	Fisher Scientific	12-550C
A1 confocal microscope	Nikon
acetone	Fisher Scientific	A9-20
antibiotic/antimycotic (penicillin/streptomycin/amphotericin)	Gibco	15240062
box cutter blade	Fisher Scientific	NC1721575
dissection scissors	Fisher Scientific	08-951-5
DMEM with 4.5 g/L glucose	Thermo Fisher Scientific	11960-044
double sided tape	Fisher Scientific	NC0879005
EGM-2	Lonza	CC-3162
Fetal Bovine Serum, Heat inactivated	Corning	MT35011CV
Fiji software	ImageJ
glass vial	Fisher Scientific	03-341-25D
glutamax	Thermo Fisher Scientific	35050061
hCMEC/D3	EMD Millipore	SCC066
Jupyter notebook	Anaconda
L-glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030081
Matrigel – growth factor reduced with phenol red	Corning	CB-40230A
MDA-MB-231	ATCC	HTB-26
MDA-MB-231-BR-GFP	Dr. Patricia Steeg, NIH
N-2 growth supplement	Thermo Fisher Scientific	17502048
normal human astrocytes (NHA)	Lonza	CC-2565
Orange software	University of Ljubljana
Pasteur pipette	Fisher Scientific	13-711-9AM
Photolithography masks	Photosciences Incorporated
pLL3.7-dsRed	University of Michigan Vector Core
pLL-EV-GFP	University of Michigan Vector Core
pLOX-TERT-iresTK	Addgene	12245
pMD2.G	Addgene	12259
polycarbonate membrane, 5um pore size	Millipore	TMTP04700
psPAX2	Addgene	12260
PureCol, 3 mg/mL	Advanced Biomatrix	5005	Type I bovine collagen
sodium bicarbonate	Thermo Fisher Scientific	25080094
sodium pyruvate	Thermo Fisher Scientific	11360070
Solo cup	Fisher Scientific	NC1416545
SU-8 2075	MicroChem Corporation	Y111074 0500L1GL
SU8 developer	MicroChem Corporation	Y020100 4000L1PE
Sylgard 184	Ellsworth Adhesive Company	NC0162601
Toluene	Sigma-Aldrich	179965-1L
Tricholoro perfluoro octyl silane	Sigma-Aldrich	448931-10G