Cuantificación del microambiente del tumor metastásico cerebral mediante un modelo 3D de chip organ-on-A, aprendizaje automático y tomografía confocal
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para preparar y cultivar un microambiente tumor metastásico de barrera hematoencefálica y luego cuantificar su estado mediante imágenes confocales e inteligencia artificial (aprendizaje automático).
Abstract
Las metástasis cerebrales son las lesiones de cáncer más letales; 10-30% de todos los cánceres hacen metástasis en el cerebro, con una mediana de supervivencia de sólo 5-20 meses, dependiendo del tipo de cáncer. Para reducir la carga tumoral metastásica del cerebro, es necesario abordar las brechas en el conocimiento básico y traslacional. Los principales desafíos incluyen una escasez de modelos preclínicos reproducibles y herramientas asociadas. Los modelos tridimensionales de metástasis cerebral pueden producir los datos moleculares y fenotípicos relevantes utilizados para abordar estas necesidades cuando se combinan con herramientas de análisis específicas. Además, en comparación con los modelos murinos, los modelos de órgano en chip de células tumorales de pacientes que atraviesan la barrera hematoencefálica hacia el microambiente cerebral generan resultados rápidamente y son más interpretables con métodos cuantitativos, por lo que son susceptibles de pruebas de alto rendimiento. Aquí describimos y demostramos el uso de una novedosa plataforma de nicho cerebral de sangre microfluídica 3D (‘mBBN’) donde múltiples elementos del nicho pueden ser cultivados durante un período prolongado (varios días), imágenes fluorescentes por microscopía confocal, y las imágenes reconstruidas utilizando una innovadora técnica de tomografía confocal; todo tenía como objetivo entender el desarrollo de la micro-metástasis y los cambios en el microambiente tumoral (TME) de una manera repetible y cuantitativa. Demostramos cómo fabricar, semillar, imagen y analizar las células cancerosas y componentes celulares y humorales TME, utilizando esta plataforma. Por otra parte, mostramos cómo se utiliza la inteligencia artificial (IA) para identificar las diferencias fenotípicas intrínsecas de las células cancerosas que son capaces de transitar a través de un modelo de mBBN y para asignarles un índice objetivo del potencial metastásico cerebral. Los conjuntos de datos generados por este método se pueden utilizar para responder preguntas básicas y traslacionales sobre la metástasis, la eficacia de las estrategias terapéuticas y el papel del TME en ambos.
Introduction
Las metástasis cerebrales son las lesiones de cáncer más letales; 10-30% de todos los cánceres metástasis en el cerebro, con una mediana de supervivencia de sólo 5-20 meses, dependiendo del tipo de cáncer1,,2. Una pregunta principal que surge al estudiar la metástasis del cáncer es cómo los sub clones migran del ambiente humoral del torrente sanguíneo a un órgano como el cerebro3,,4. Esta pregunta ha dado lugar a muchas variaciones de los ensayos de migración, invasión y extravasación. Todos estos métodos comparten el paso crítico de contar o medir las propiedades de las células que se mueven de una ubicación a otra en respuesta a un estímulo. La mayoría de los ensayos de migración fácilmente disponibles se utilizan para estudiar la migración bidimensional (2D) de células cancerosas. Estos han aclarado una gran cantidad de conocimiento; sin embargo, no recapitulan la naturaleza tridimensional del sistema in vivo que otros métodos pueden proporcionar5. Por lo tanto, es necesario estudiar el microambiente tumoral (TME) en sistemas tridimensionales (3D), pero los enfoques de análisis disponibles para las estructuras 3D son limitados y a menudo inconsistentes.
Una de las herramientas 3D más populares es una cámara Boyden que consiste en una membrana suspendida en la parte inferior de un pozo, separando dos regiones distintas. Boyden introdujo el ensayo para estudiar la quimiotaxis de leucocitos4. Las regiones inferiores pueden variar por química u otros medios6,7 para inducir a las células de la región superior a migrar a la región inferior. El enfoque más común para cuantificar el número de células que han migrado es liberar las células de la parte inferior de la membrana utilizando una solución tampón, anlicerlas y luego contarlas en función de la cantidad de contenido de ADN en la solución7. Este enfoque indirecto es propenso a errores del operador debido a la variabilidad de la técnica y el procedimiento destruye información sobre el fenotipo de cáncer y el microambiente. Las variaciones del ensayo de la cámara boyden implican la fijación de células migratorias que permanecen en la membrana, pero sólo proporciona un recuento de células que ya no son viables para el estudio continuo6,,8,,9.
Debido a las limitaciones de la cámara Boyden y al crecimiento de las innovaciones en la comunidad microfluídica, se han desarrollado chips de ensayo de migración que observan el movimiento de las células en respuesta a un estímulo en una dirección en lugar de tres10,,11,,12. Estos ensayos de migración facilitan el control sobre factores como el flujo o la separación de una sola célula13,14 que permiten una mejor interpretación de los resultados; sin embargo, su formato 2D inevitablemente pierde cierta información dinámica. Estudios recientes se han centrado en la extravasación (es decir, el movimiento de las células de la circulación a un tejido, como la barrera hematoencefálica) en un entorno 3D14,,15. La distancia de extravasación en el tejido y el comportamiento de sondeo que se produce en la barrera celular / membrana es más refinado que las mediciones obtenidas utilizando la cámara Boyden o un dispositivo de migración microfluídica 2D16. Por lo tanto, los dispositivos que permiten la creación de imágenes y el análisis adecuados de la extravasación 3D son fundamentales para capturar estas mediciones sofisticadas, pero carecen de literatura.
Independientemente de los ensayos de migración, se han desarrollado técnicas de imagen robustas para la resonancia magnética (RM) y la tomografía que son capaces de identificar y reconstruir con precisión el tejido en el espacio 3D17,,18. Estas técnicas adquieren imágenes en pilas z y partes de segmentos de la imagen basadas en las propiedades del tejido y luego convierten las imágenes segmentadas en mallas tridimensionales19,,20,,21. Esto permite a los médicos visualizar en 3D órganos individuales, huesos y vasos para ayudar en la planificación quirúrgica o ayuda en el diagnóstico de cáncer o enfermedades del corazón22,,23. Aquí, mostraremos que estos enfoques se pueden adaptar para su uso en muestras microscópicas y dispositivos de extravasación 3D.
Para ello, desarrollamos la innovadora técnica de tomografía confocal, presentada en el presente documento, que ofrece flexibilidad para estudiar la extravasación de células tumorales a través de una membrana mediante la adaptación de las herramientas de tomografía existentes. Este enfoque permite el estudio de la gama completa de comportamientos de las células cancerosas a medida que interactúan con una barrera celular, como una capa celular endotelial. Las células cancerosas exhiben comportamientos de sondeo; algunos pueden invadir pero permanecer cerca de la membrana, mientras que otros atraviesan la barrera fácilmente. Esta técnica es capaz de producir información sobre el fenotipo de la célula en todas las dimensiones24. El uso de este enfoque para estudiar el TME es relativamente barato, fácil de interpretar y reproducible, en comparación con modelos murina in vivo más complejos. La metodología presentada debe proporcionar una base sólida para el estudio de muchos tipos de tumores y microambientes mediante la adaptación de la región estromal.
Describimos y demostramos el uso de una plataforma de nicho de cerebro encefádico microfluídico 3D(Figura 1) donde los elementos críticos de la barrera y el nicho (células endoteliales microvasculares cerebrales y astrocitos) pueden ser cultivados durante un período prolongado (aproximadamente hasta 9 días), imágenes fluorescentes por microscopía confocal, y las imágenes reconstruidas utilizando nuestra técnica de tomografía confocal(Figura 2); todo tenía como objetivo entender el desarrollo de la micro-metástasis y los cambios en el microambiente tumoral de una manera repetible y cuantitativa. La interfaz de barrera hematoencefálica con el nicho cerebral se compone de células endoteliales microvasculares cerebrales que se fortalecen mediante membrana de sótano, pies de astrocito y pericitos25. Nos centramos selectivamente en los componentes astrocitos y endoteliales dada su importancia en la formación y regulación de la barrera hematoencefálica. Demostramos cómo fabricar, semilla, imagen y analizar las células cancerosas y los componentes celulares y humorales del microambiente tumoral, utilizando esta plataforma. Por último, mostramos cómo se puede utilizar el aprendizaje automático para identificar las diferencias fenotípicas intrínsecas de las células cancerosas que son capaces de transitar a través de un modelo de bBBN y para asignarles un índice objetivo del potencial metastásico cerebral24. Los conjuntos de datos generados por este método se pueden utilizar para responder preguntas básicas y traslacionales sobre metástasis, estrategias terapéuticas y el papel del TME en ambos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hemos desarrollado y presentado un nuevo método que adapta las herramientas que a menudo se utilizan en los análisis de imágenes clínicas para la medición de la extravasación y la migración de las células cancerosas a través de una barrera endotelial en el tejido cerebral. Planteamos que este enfoque puede ser útil para mediciones in vivo e in vitro; hemos demostrado su uso en un sistema microfluídico 3D recapitulando la vasculatura cerebral. Las mediciones de células cancerosas, incluida la distancia extrava…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al Laboratorio Steeg, en el Instituto Nacional del Cáncer por la generosa donación de células MDA-MB-231-BR-GFP. La microscopía confocal se realizó en el Instituto de Biointerfaces de la Universidad de Michigan (BI). La citometría de flujo se realizó en el núcleo de citometría de flujo de la Universidad de Michigan. Los vectores virales fueron creados por la Universidad de Michigan Vector Core. También agradecemos a Kelley Kidwell por la orientación en el análisis estadístico de estos datos.
Financiación:
C.R.O. fue parcialmente apoyado por una Beca de Capacitación NIH T-32 (T32CA009676) y 1R21CA245597-01. T.M.W. fue parcialmente apoyado por 1R21CA245597-01 y el Centro Nacional para el Avance de las Ciencias Traslacionales de los Institutos Nacionales de Salud bajo el número de premio UL1TR002240. La financiación de materiales y caracterización fue proporcionada por el Instituto Nacional del Cáncer de los Institutos Nacionales de Salud bajo el número de premio 1R21CA245597-01, P30CA046592, 5T32CA009676-23, CA196018, AI116482, Fundación METAvivor y la Fundación de Investigación del Cáncer. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los Institutos Nacionales de Salud
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA with phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| 1.5 mm biopsy punch with plunger | Integra LifeSciences Corporation | 33-31A-P/25 | |
| 10x MEM | Thermo Fisher Scientific | 11430030 | |
| 150 mm petri dishes | Fisher Scientific | FB0875714 | |
| 1x DPBS, without Ca and Mg | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
| 200uL pipette tip | Fisher Scientific | 02-707-411 | |
| 4 inch silicon wafer | University Wafer | 452 | |
| 48 mm wide packing tape | Fisher Scientific | 19-072-097 | |
| 50 x 75 mm glass slide | Fisher Scientific | 12-550C | |
| A1 confocal microscope | Nikon | ||
| acetone | Fisher Scientific | A9-20 | |
| antibiotic/antimycotic (penicillin/streptomycin/amphotericin) | Gibco | 15240062 | |
| box cutter blade | Fisher Scientific | NC1721575 | |
| dissection scissors | Fisher Scientific | 08-951-5 | |
| DMEM with 4.5 g/L glucose | Thermo Fisher Scientific | 11960-044 | |
| double sided tape | Fisher Scientific | NC0879005 | |
| EGM-2 | Lonza | CC-3162 | |
| Fetal Bovine Serum, Heat inactivated | Corning | MT35011CV | |
| Fiji software | ImageJ | ||
| glass vial | Fisher Scientific | 03-341-25D | |
| glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| hCMEC/D3 | EMD Millipore | SCC066 | |
| Jupyter notebook | Anaconda | ||
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| Matrigel – growth factor reduced with phenol red | Corning | CB-40230A | |
| MDA-MB-231 | ATCC | HTB-26 | |
| MDA-MB-231-BR-GFP | Dr. Patricia Steeg, NIH | ||
| N-2 growth supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| normal human astrocytes (NHA) | Lonza | CC-2565 | |
| Orange software | University of Ljubljana | ||
| Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-711-9AM | |
| Photolithography masks | Photosciences Incorporated | ||
| pLL3.7-dsRed | University of Michigan Vector Core | ||
| pLL-EV-GFP | University of Michigan Vector Core | ||
| pLOX-TERT-iresTK | Addgene | 12245 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| polycarbonate membrane, 5um pore size | Millipore | TMTP04700 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| PureCol, 3 mg/mL | Advanced Biomatrix | 5005 | Type I bovine collagen |
| sodium bicarbonate | Thermo Fisher Scientific | 25080094 | |
| sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | |
| Solo cup | Fisher Scientific | NC1416545 | |
| SU-8 2075 | MicroChem Corporation | Y111074 0500L1GL | |
| SU8 developer | MicroChem Corporation | Y020100 4000L1PE | |
| Sylgard 184 | Ellsworth Adhesive Company | NC0162601 | |
| Toluene | Sigma-Aldrich | 179965-1L | |
| Tricholoro perfluoro octyl silane | Sigma-Aldrich | 448931-10G |
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