Här presenterar vi ett protokoll för att förbereda och culturing en blod hjärnbarriären ögonbevarande tumör mikro-miljö och sedan kvantifiera sitt tillstånd med hjälp av konfokal avbildning och artificiell intelligens (maskininlärning).
Hjärnmetastaser är de mest dödliga cancerlesionerna; 10-30% av alla cancerformer metastasera till hjärnan, med en median överlevnad på endast ~ 5-20 månader, beroende på cancer typ. För att minska hjärnan metastaserande tumör börda, luckor i grundläggande och translationella kunskaper måste åtgärdas. Stora utmaningar är bland annat en brist på reproducerbara prekliniska modeller och tillhörande verktyg. Tredimensionella modeller av hjärnmetastas kan ge de relevanta molekylära och fenotypiska data som används för att hantera dessa behov när de kombineras med dedikerade analysverktyg. Dessutom, jämfört med murine modeller, organ-on-a-chip modeller av patientens tumörceller korsar blod-hjärnbarriären i hjärnan mikromiljö generera resultat snabbt och är mer tolkningsbara med kvantitativa metoder, alltså mottagliga för hög genomströmning testning. Här beskriver vi och demonstrerar användningen av en ny 3D mikrofluidic blod hjärnan nisch (μmBBN) plattform där flera delar av nischen kan odlas under en längre period (flera dagar), fluorescerande avbildas av confocal mikroskopi, och bilderna rekonstrueras med hjälp av en innovativ konfokal tomografi teknik; alla syftar till att förstå utvecklingen av mikro-metastasering och förändringar av tumören mikro-miljö (TME) i en repeterbar och kvantitativt sätt. Vi visar hur man fabricerar, frö, bild, och analysera cancerceller och TME cellulära och humorala komponenter, med hjälp av denna plattform. Dessutom visar vi hur artificiell intelligens (AI) används för att identifiera de inneboende fenotypiska skillnader cancerceller som kan passera genom en modell μmBBN och att tilldela dem ett objektivt index för hjärnans metastaserande potential. De datamängder som genereras av denna metod kan användas för att svara på grundläggande och translationella frågor om metastasering, effekten av terapeutiska strategier, och den roll som TME i båda.
Hjärnmetastaser är de mest dödliga cancerlesionerna; 10-30% av alla cancerformer metastasera till hjärnan, med en median överlevnad på endast ~ 5-20 månader, beroende på cancer typ1,2. En huvudfråga som uppstår vid studier av cancermetastas är hur subkloner migrerar från blodomloppets humorala miljö till ett organ som hjärnan3,4. Denna fråga har lett till många varianter av migration, invasion, och extravasation assays. Alla dessa metoder delar det kritiska steget att räkna eller mäta egenskaper hos celler som rör sig från en plats till en annan som svar på en stimulans. De flesta migrationsanalyser lätt tillgängliga används för att studera tvådimensionell (2D) migration av cancerceller. Dessa har klarlagt en rikedom av kunskap; de rekapitulerar dock inte den tredimensionella karaktär av in vivo-systemet som andra metoder kan ge5. Därför är det nödvändigt att studera tumör mikro-miljö (TME) i tredimensionella (3D) system, men analysen metoder som finns för 3D-strukturer är begränsade och ofta inkonsekvent.
En av de mest populära 3D-verktyg är en Boyden kammare som består av ett membran upphängd längst ner i en brunn, som skiljer två olika regioner. Boyden introducerade analysen för att studera leukocyte chemotaxis4. De nedre regionerna kan varieras med hjälp av kemieller andra medel 6,7 för att förmå celler i den övre regionen att migrera till den nedre regionen. Den vanligaste metoden för att kvantifiera antalet celler som har migrerat är att frigöra cellerna från botten av membranet med hjälp av en buffertlösning, lysa dem, och sedan räkna dem baserat på mängden DNA-innehåll i lösningen7. Denna indirekta metod är benägen att operatör fel på grund av tekniken variabilitet och förfarandet förstör information om cancer fenotyp och mikro-miljö. Variationer av Boyden kammaren assay innebära fixering av flyttande celler som finns kvar på membranet, men bara ger en räkning av celler som inte längre är livskraftiga för fortsatt studie6,8,9.
På grund av begränsningar i Boyden kammaren och tillväxten av innovationer i mikrofluidic gemenskapen, migration assay chips har utvecklats som observerar rörelse av celler som svar på en stimulans i en riktning snarare äntre 10,11,12. Dessa migreringsanalyser underlättar kontroll över faktorer som flöde eller encellsseparering13,14 som möjliggör bättre tolkning av resultaten; dock förlorar deras 2D-format oundvikligen en del dynamisk information. Nyligen genomförda studier har fokuserat på extravasation (dvs. förflyttning av celler från cirkulationen till en vävnad, såsom blod-hjärnbarriären) i en 3D-miljö14,15. Den extravasering avstånd till vävnad och sondering beteende som uppstår vid cellulära barriär / membran är mer raffinerad än mätningar som samlats in med antingen Boyden kammaren eller en 2D mikrofluidic migrationenhet 16. Enheter som möjliggör lämplig bildbehandling och analys av 3D-extravasering är således avgörande för att fånga dessa sofistikerade mätningar men saknas i litteraturen.
Oberoende av migreringsanalyser har robusta avbildningstekniker utvecklats för magnetresonanstomografi (MRT) och tomografi som kan identifiera och exakt rekonstruera vävnad i 3D-rymden17,18. Dessa tekniker förvärva bilder i z-stackar och segment delar av bilden baserat på egenskaperna hos vävnaden och sedan omvandla de segmenterade bilderna i tredimensionella maskor19,20,21. Detta gör det möjligt för läkare att visualisera i 3D enskilda organ, ben, och fartyg till stöd i kirurgisk planering eller stöd vid diagnos av cancer eller hjärtsjukdom22,23. Här kommer vi att visa att dessa tillvägagångssätt kan anpassas för användning på mikroskopiska exemplar och 3D extravasering enheter.
För detta ändamål utvecklade vi den innovativa confocal tomografi teknik, som presenteras häri, som ger flexibilitet att studera extravasation av tumörceller över ett membran genom att anpassa befintliga tomografi verktyg. Detta tillvägagångssätt möjliggör studier av hela spektrat av cancercell beteenden som de interagerar med en cellulär barriär, såsom en endotel cellskikt. Cancerceller uppvisar sonderingsbeteenden; vissa kan invadera men förblir nära membranet, medan andra korsar barriären lätt. Denna teknik är kapabel att ge information om fenotyp av cellen i alla dimensioner24. Att använda detta tillvägagångssätt för att studera TME är både relativt billigt, lättolkande och reproducerbart, jämfört med mer komplexa in vivo murine-modeller. Den presenterade metodiken bör ge en stark grund för studier av många typer av tumörer och mikromiljöer genom att anpassa regionen stromal.
Vi beskriver och demonstrerar användningen av en 3D-mikrofluidisk blodhjärnenisch (μmBBN) plattform (Figur 1) där kritiska element i barriären och nischen (hjärnans mikrovaskulära endotelceller och astrocyter) kan odlas under en längre period (ungefär upp till 9 dagar), fluorescerande avbildad av konfokalmikroskopi, och bilderna rekonstruerade med hjälp av vår confo tomografiteknik (Figur 2); alla syftar till att förstå utvecklingen av mikro-metastasering och förändringar i tumören mikro-miljö i en upprepningsbar och kvantitativt sätt. Blod-hjärnbarriären gränssnitt med hjärnan nisch är sammansatt av hjärnans mikrovaskulära endotelceller som stärks av källaren membran, astrocyte fot, och pericyter25. Vi fokuserade selektivt på astrocyten och endotelkomponenterna med tanke på deras betydelse i bildandet och regleringen av blod-hjärnbarriären. Vi visar hur man fabricerar, frö, bild, och analysera cancerceller och tumör mikro-miljö cellulära och humorala komponenter, med hjälp av denna plattform. Slutligen visar vi hur maskininlärning kan användas för att identifiera de inneboende fenotypiska skillnader av cancerceller som är kapabla att transitera genom en modell μmBBN och att tilldela dem ett objektivt index för hjärnans metastaserande potential24. De datamängder som genereras av denna metod kan användas för att svara på grundläggande och translationella frågor om metastasering, terapeutiska strategier och TME:s roll i båda.
Vi har utvecklat och presenterat en ny metod som anpassar verktyg som ofta utnyttjas i kliniska bildframställningsanalyser för mätning av extravasation och migration av cancerceller genom en endotelbarriär till hjärnvävnad. Vi utgör detta tillvägagångssätt kan vara användbart för både in vivo och in vitro-mätningar; vi har visat dess användning på en 3D microfluidic system recapitulating hjärnan vasculature. Cancer cell mätningar inklusive avstånd extravasated, procent extravasated by volym, sfäricite…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Steeg Lab, vid National Cancer Institute för generös donation av MDA-MB-231-BR-GFP celler. Confocal mikroskopi utfördes vid University of Michigan Biointerfaces Institute (BI). Flödescytometri utfördes vid University of Michigan Flow Cytometry Core. Viral vektorer skapades av University of Michigan Vector Core. Vi tackar också Kelley Kidwell för vägledning i statistisk analys av dessa data.
Finansiering:
C.R.O. stöddes delvis av ett NIH T-32 Training Fellowship (T32CA009676) och 1R21CA245597-01. T.M.W. stöddes delvis av 1R21CA245597-01 och National Center for Advancing Translational Sciences of the National Institutes of Health under Award Number UL1TR002240. Finansiering för material och karakterisering tillhandahölls av National Cancer Institute of the National Institutes of Health under tilldelning nummer 1R21CA245597-01, P30CA046592, 5T32CA009676-23, CA196018, AI116482, METAvivor Foundation och Breast Cancer Research Foundation. Innehållet är ensamt författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis de officiella åsikterna från National Institutes of Health
0.25% Trypsin-EDTA with phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
1.5 mm biopsy punch with plunger | Integra LifeSciences Corporation | 33-31A-P/25 | |
10x MEM | Thermo Fisher Scientific | 11430030 | |
150 mm petri dishes | Fisher Scientific | FB0875714 | |
1x DPBS, without Ca and Mg | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
200uL pipette tip | Fisher Scientific | 02-707-411 | |
4 inch silicon wafer | University Wafer | 452 | |
48 mm wide packing tape | Fisher Scientific | 19-072-097 | |
50 x 75 mm glass slide | Fisher Scientific | 12-550C | |
A1 confocal microscope | Nikon | ||
acetone | Fisher Scientific | A9-20 | |
antibiotic/antimycotic (penicillin/streptomycin/amphotericin) | Gibco | 15240062 | |
box cutter blade | Fisher Scientific | NC1721575 | |
dissection scissors | Fisher Scientific | 08-951-5 | |
DMEM with 4.5 g/L glucose | Thermo Fisher Scientific | 11960-044 | |
double sided tape | Fisher Scientific | NC0879005 | |
EGM-2 | Lonza | CC-3162 | |
Fetal Bovine Serum, Heat inactivated | Corning | MT35011CV | |
Fiji software | ImageJ | ||
glass vial | Fisher Scientific | 03-341-25D | |
glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
hCMEC/D3 | EMD Millipore | SCC066 | |
Jupyter notebook | Anaconda | ||
L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
Matrigel – growth factor reduced with phenol red | Corning | CB-40230A | |
MDA-MB-231 | ATCC | HTB-26 | |
MDA-MB-231-BR-GFP | Dr. Patricia Steeg, NIH | ||
N-2 growth supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
normal human astrocytes (NHA) | Lonza | CC-2565 | |
Orange software | University of Ljubljana | ||
Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-711-9AM | |
Photolithography masks | Photosciences Incorporated | ||
pLL3.7-dsRed | University of Michigan Vector Core | ||
pLL-EV-GFP | University of Michigan Vector Core | ||
pLOX-TERT-iresTK | Addgene | 12245 | |
pMD2.G | Addgene | 12259 | |
polycarbonate membrane, 5um pore size | Millipore | TMTP04700 | |
psPAX2 | Addgene | 12260 | |
PureCol, 3 mg/mL | Advanced Biomatrix | 5005 | Type I bovine collagen |
sodium bicarbonate | Thermo Fisher Scientific | 25080094 | |
sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | |
Solo cup | Fisher Scientific | NC1416545 | |
SU-8 2075 | MicroChem Corporation | Y111074 0500L1GL | |
SU8 developer | MicroChem Corporation | Y020100 4000L1PE | |
Sylgard 184 | Ellsworth Adhesive Company | NC0162601 | |
Toluene | Sigma-Aldrich | 179965-1L | |
Tricholoro perfluoro octyl silane | Sigma-Aldrich | 448931-10G |