Organ-On-A Chip 3D Modeli, Makine Öğrenimi ve Konfokal Tomografi Kullanarak Beyin Metastatik Tümör Mikro-Ortamının Ölçülmesi
Summary
Burada, bir kan beyin bariyeri metastatik tümör mikro-ortamının hazırlanması ve kültürlenmesi ve konfokal görüntüleme ve yapay zeka (makine öğrenimi) kullanılarak durumunun ölçülmesi için bir protokol saklıyız.
Abstract
Beyin metastazları en ölümcül kanser lezyonlarıdır; Tüm kanserlerin% 10-30 beyne metastaz, sadece ~ 5-20 ay bir ortanca sağkalım ile, kanser türüne bağlı olarak. Beyin metastatik tümör yükünü azaltmak için, temel ve çevirisel bilgi boşlukları ele alınması gerekir. Başlıca zorluklar arasında tekrarlanabilir preklinik modellerin ve ilişkili araçların azlığı sayılabilir. Beyin metastazı üç boyutlu modelleri özel analiz araçları ile kombine edildiğinde bu ihtiyaçları karşılamak için kullanılan ilgili moleküler ve henotypic veri verim olabilir. Ayrıca, murine modelleri ile karşılaştırıldığında, beyin mikroortamına kan beyin bariyerini geçen hasta tümör hücrelerinin organ-on-a-chip modelleri hızla sonuç üretmek ve kantitatif yöntemlerle daha yorumlanabilir, böylece yüksek iş artışı testi için uygun. Burada, nişin birden fazla elementinin uzun bir süre (birkaç gün) kültürlenebileceği, konfokal mikroskopi ile floresan olarak görüntülenebileceği ve yenilikçi bir konfokal tomografi tekniği kullanılarak yeniden yapılandırılan görüntülerin bulunduğu yeni bir 3D mikroakışkan kan beyin niş (μmBBN) platformunun kullanımını tanımlıyor ve gösteriyoruz; mikro-metastaz ın gelişimini ve tümör mikro-ortamında (TME) tekrarlanan ve kantitatif bir şekilde değişimlerini anlamayı amaçlamıştır. Bu platformu kullanarak kanser hücrelerini ve TME hücresel ve mizahi bileşenlerini nasıl imal edebileceğimizi, tohumla, imaja nasıl üretebileceğimizi ve analiz edebileceğimizi gösteriyoruz. Ayrıca, yapay zekanın (AI) bir model μmBBN ile geçiş yeteneğine sahip kanser hücrelerinin içsel phenotipik farklılıklarını belirlemek ve onlara beyin metastatik potansiyelinin nesnel bir indeks atamak için nasıl kullanıldığını gösteriyoruz. Bu yöntemle oluşturulan veri kümeleri metastaz, terapötik stratejilerin etkinliği ve TME’nin her ikisinde de rolü hakkındaki temel ve çevirisel soruları yanıtlamak için kullanılabilir.
Introduction
Beyin metastazları en ölümcül kanser lezyonlarıdır; Tüm kanserlerin% 10-30 beyne metastaz, sadece ~ 5-20 ay bir ortanca sağkalım ile, kanser türüne bağlı olarak1,2. Kanser metastazı incelenirken ortaya çıkan bir temel soru nasıl alt klonlarbeyingibi bir organiçine kan dolaşımının mizah ortamından göç nasıl3 ,4. Bu soru göç, istila ve ekstravazasyon tahlilleri birçok varyasyonyol açmıştır. Tüm bu yöntemler, bir uyarıcıya yanıt olarak bir konumdan diğerine hareket eden hücrelerin özelliklerini sayma veya ölçme nin kritik adımını paylaşır. Çoğu göç tahlilleri kolayca kullanılabilir kanser hücrelerinin iki boyutlu (2D) göç çalışma için kullanılır. Bunlar bir bilgi zenginliğini aydınlatmıştır; ancak, diğeryöntemlerin 5sağlayabilir in vivo sisteminin üç boyutlu doğasını özetlemek yok. Bu nedenle, tümör mikro-çevre (TME) üç boyutlu (3D) sistemlerde incelenmesi gereklidir, ancak 3D yapılar için mevcut analiz yaklaşımları sınırlı ve genellikle tutarsız.
En popüler 3D araçlardan biri, iki farklı bölgeyi ayıran bir kuyunun dibinde asılı bir membrandan oluşan bir Boyden odasıdır. Boyden lökosit chemotaxis4çalışma için titret tanıttı. Alt bölgeler kimya veya diğer araçlarla farklı olabilir6,7 alt bölgeye göç etmek için üst bölgedeki hücreleri ikna etmek için. Göç eden hücre sayısını ölçmek için en yaygın yaklaşım, hücreleri bir tampon çözeltisi kullanarak membranın alt kısmından serbest bırakmak, onları lyse ve daha sonra çözeltideki DNA içeriği miktarına göre saymaktır7. Bu dolaylı yaklaşım teknik değişkenliği nedeniyle operatör hatasına yatkındır ve prosedür kanser fenotip ve mikro-çevre hakkında bilgi yok eder. Boyden odası tsay varyasyonları membran üzerinde kalan göçmen hücrelerinin fiksasyonu içerir, ama sadece artık devam çalışmaiçinuygun olan hücrelerin sayısını sağlar 6,8,9.
Boyden odası sınırlamaları ve mikroakışkan toplumda yeniliklerin büyüme nedeniyle, göç taşkınlık yongaları üç10yerine bir yönde bir uyarıcı yanıt olarak hücrelerin hareketini gözlemlemek geliştirilmiştir10 ,11,12. Bu geçiş tahlilleri, sonuçların daha iyi yorumlanmasını sağlayan akış veya tek hücre ayrımı13,14 gibi faktörler üzerinde kontrolü kolaylaştırır; ancak, onların 2D biçimi kaçınılmaz olarak bazı dinamik bilgi kaybeder. Son çalışmalar extravazasyon üzerinde duruldu (yani, bir doku içine dolaşımdan hücrelerin hareketi, kan beyin bariyeri gibi) bir 3D ortamda14,15. Doku içine ekstravazasyon mesafesi ve hücresel bariyer / membran oluşur probing davranışı boyden odası veya 2D mikroakışkan göç cihazı16kullanılarak toplanan ölçümler daha rafine. Bu nedenle, 3D ekstravazasyonun uygun görüntüleme ve analizini sağlayan cihazlar bu gelişmiş ölçümleri yakalamak için kritik öneme sahip olmakla birlikte literatürde eksiktir.
Göç tahlillerinden bağımsız olarak manyetik rezonans görüntüleme (MRG) ve tomografi için 3Boyutlu alanda dokuyu tanımlayabilen ve doğru bir şekilde yeniden yapılandırabilen sağlam görüntüleme teknikleri geliştirilmiştir17,18. Bu teknikler doku özelliklerine göre görüntünün z-yığınları ve segment bölümlerinde görüntüleri elde ve daha sonra üç boyutlu meshes19,,20,21içine segmentli görüntüleri dönüştürmek . Bu hekimlerin 3D bireysel organlar, kemikler ve damarlar kanser veya kalp hastalığı tanısında cerrahi planlama veya yardım yardımcı görselleştirmek için izin verir22,23. Burada, bu yaklaşımların mikroskobik numuneler ve 3D ekstravazasyon cihazlarında kullanılmak üzere uyarlanabileceğini göstereceğiz.
Bu amaçla, mevcut tomografi araçlarını uyarlayarak tümör hücrelerinin bir membran üzerinde ekstravazasyonunu inceleme esnekliği sağlayan, burada sunulan yenilikçi konfokal tomografi tekniğini geliştirdik. Bu yaklaşım, bir endotel hücre tabakası gibi hücresel bir bariyer ile etkileşim gibi kanser hücresi davranışlarının tam gam çalışma sağlar. Kanser hücreleri sondalama davranışları sergilerler; bazıları istila edebilir ama zara yakın kalırken, diğerleri bariyeri kolayca geçer. Bu teknik tüm boyutlarda hücrenin fenotip hakkında bilgi verebilme yeteneğine sahiptir24. TME’yi incelemek için bu yaklaşımı kullanmak hem nispeten ucuz, yorumlanması kolay, hem de daha karmaşık in vivo murine modelleriile karşılaştırıldığında tekrarlanabilir. Sunulan metodoloji stromal bölgeyi uyarlayarak birçok tümör ve mikro ortam türünün incelenmesi için güçlü bir temel oluşturmalıdır.
Bariyer ve nişin (beyin mikrovasküler endotel hücreleri ve astrositler) kritik unsurlarının uzun bir süre (yaklaşık 9 güne kadar) kültürlenebileceği, konfokal mikroskopi tekniğiile floresan olarak görüntülenebileceği ve konfokal tomografi tekniği(Şekil 2)kullanılarak yeniden yapılandırılan görüntülerin 3Boyutlu mikroakışkan kan beyin nişi (Şekil1) (Şekil 1)kullanımını tanımlıyor ve gösteriyoruz . mikro-metastaz ın gelişimini ve tümör mikro-ortamındaki değişiklikleri tekrarlanabilir ve kantitatif bir şekilde anlamayı amaçlamıştır. Beyin niş ile kan beyin bariyer arayüzü bazal membran tarafından güçlendirilir beyin mikrovasküler endotel hücreleri oluşur, astrosit ayaklar, ve perisitler25. Biz seçici kan beyin bariyerinin oluşumu ve düzenlenmesinde önemi göz önüne alındığında astrosit ve endotel bileşenleri üzerinde duruldu. Bu platformu kullanarak kanser hücrelerini ve tümör mikro-çevre hücresel ve mizahi bileşenlerini nasıl imal edebileceğimizi, tohumla, imaja nasıl üretebileceğimizi ve analiz edebileceğimizi gösteriyoruz. Son olarak, makine öğreniminin, bir model μmBBN ile geçiş yeteneğine sahip kanser hücrelerinin içsel phenotipik farklılıklarını belirlemek ve onlara beyin metastatik potansiyelinin nesnel bir indeksini atamak için nasıl kullanılabileceğini gösteriyoruz24. Bu yöntemle oluşturulan veri kümeleri metastaz, tedavi stratejileri ve TME’nin her ikisinde de rolü hakkındaki temel ve çevirisel soruları yanıtlamak için kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kanser hücrelerinin beyin dokusuna endotel bariyerinden ekstravazasyon ve göçünün ölçümü için klinik görüntüleme analizlerinde sıklıkla kullanılan araçları uyarlayan yeni bir yöntem geliştirdik ve sunduk. Biz bu yaklaşımın hem in in in in in in in vitro ölçümler için yararlı olabilir poz; beyin vaskülatürünü özetlemek için 3 Boyutlu mikroakışkan bir sistem üzerinde kullanıldığını gösterdik. Ekstravasated mesafe, hacim, sphericity ve hacim tarafından ekstravazlanmış yüzde dah…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz MDA-MB-231-BR-GFP hücrelerinin cömert bağış için Ulusal Kanser Enstitüsü’nde Steeg Lab teşekkür ederiz. Konfokal mikroskopi Michigan Üniversitesi Biyoarayüz enstitüsünde (BI) gerçekleştirildi. Akış sitometrimichigan Flow Sitometri Core Üniversitesi’nde yapıldı. Viral vektörler Michigan Vektör Çekirdeği Üniversitesi tarafından oluşturuldu. Ayrıca Kelley Kidwell’e bu verilerin istatistiksel analizinde rehberlik ettiği için teşekkür ederiz.
Finansman:
C.R.O. kısmen NIH T-32 Eğitim Bursu (T32CA009676) ve 1R21CA245597-01 tarafından desteklenmiştir. T.M.W. kısmen 1R21CA245597-01 ve Ul1TR002240 Ödül Numarası altında Ulusal Sağlık Enstitüleri Çeviri Bilimleri İlerletme Merkezi tarafından kısmen desteklenmiştir. Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Kanser Enstitüsü tarafından 1R21CA245597-01, P30CA046592, 5T32CA009676-23, CA196018, AI116482, METAvivor Vakfı ve Meme Kanseri Araştırma Vakfı ödül numarası altında malzeme ve karakterizasyon için finansman sağlanmıştır. İçerik sadece yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri’nin resmi görüşlerini temsil etmemektedir.
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA with phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| 1.5 mm biopsy punch with plunger | Integra LifeSciences Corporation | 33-31A-P/25 | |
| 10x MEM | Thermo Fisher Scientific | 11430030 | |
| 150 mm petri dishes | Fisher Scientific | FB0875714 | |
| 1x DPBS, without Ca and Mg | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
| 200uL pipette tip | Fisher Scientific | 02-707-411 | |
| 4 inch silicon wafer | University Wafer | 452 | |
| 48 mm wide packing tape | Fisher Scientific | 19-072-097 | |
| 50 x 75 mm glass slide | Fisher Scientific | 12-550C | |
| A1 confocal microscope | Nikon | ||
| acetone | Fisher Scientific | A9-20 | |
| antibiotic/antimycotic (penicillin/streptomycin/amphotericin) | Gibco | 15240062 | |
| box cutter blade | Fisher Scientific | NC1721575 | |
| dissection scissors | Fisher Scientific | 08-951-5 | |
| DMEM with 4.5 g/L glucose | Thermo Fisher Scientific | 11960-044 | |
| double sided tape | Fisher Scientific | NC0879005 | |
| EGM-2 | Lonza | CC-3162 | |
| Fetal Bovine Serum, Heat inactivated | Corning | MT35011CV | |
| Fiji software | ImageJ | ||
| glass vial | Fisher Scientific | 03-341-25D | |
| glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| hCMEC/D3 | EMD Millipore | SCC066 | |
| Jupyter notebook | Anaconda | ||
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| Matrigel – growth factor reduced with phenol red | Corning | CB-40230A | |
| MDA-MB-231 | ATCC | HTB-26 | |
| MDA-MB-231-BR-GFP | Dr. Patricia Steeg, NIH | ||
| N-2 growth supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| normal human astrocytes (NHA) | Lonza | CC-2565 | |
| Orange software | University of Ljubljana | ||
| Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-711-9AM | |
| Photolithography masks | Photosciences Incorporated | ||
| pLL3.7-dsRed | University of Michigan Vector Core | ||
| pLL-EV-GFP | University of Michigan Vector Core | ||
| pLOX-TERT-iresTK | Addgene | 12245 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| polycarbonate membrane, 5um pore size | Millipore | TMTP04700 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| PureCol, 3 mg/mL | Advanced Biomatrix | 5005 | Type I bovine collagen |
| sodium bicarbonate | Thermo Fisher Scientific | 25080094 | |
| sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | |
| Solo cup | Fisher Scientific | NC1416545 | |
| SU-8 2075 | MicroChem Corporation | Y111074 0500L1GL | |
| SU8 developer | MicroChem Corporation | Y020100 4000L1PE | |
| Sylgard 184 | Ellsworth Adhesive Company | NC0162601 | |
| Toluene | Sigma-Aldrich | 179965-1L | |
| Tricholoro perfluoro octyl silane | Sigma-Aldrich | 448931-10G |
References
- Rastogi, K., et al. Palliation of Brain Metastases: Analysis of Prognostic Factors Affecting Overall Survival. Indian Journal of Palliative Care. 24 (3), 308-312 (2018).
- Wang, R., et al. The Clinicopathological features and survival outcomes of patients with different metastatic sites in stage IV breast cancer. BMC Cancer. 19 (1), 1091 (2019).
- Valster, A., et al. Cell migration and invasion assays. Methods. 37 (2), 208-215 (2005).
- Eccles, S. A., Box, C., Court, W. Cell migration/invasion assays and their application in cancer drug discovery. Biotechnology Annual Review. 11, 391-421 (2005).
- Brekhman, V., Neufeld, G. A novel asymmetric 3D in-vitro assay for the study of tumor cell invasion. BMC Cancer. 9, 415 (2009).
- Chen, H. C. Boyden chamber assay. Methods in Molecular Biology. 294, 15-22 (2005).
- Poissonnier, A., Legembre, P. Boyden Chamber Assay to Study of Cell Migration Induced by Metalloprotease Cleaved-CD95L. Methods in Molecular Biology. 1557, 117-123 (2017).
- Li, X., Yang, H., Huang, H., Zhu, T. CELLCOUNTER: novel open-source software for counting cell migration and invasion in vitro. BioMed Research International. 2014, 863564 (2014).
- Little, A. C., et al. IL-4/IL-13 Stimulated Macrophages Enhance Breast Cancer Invasion Via Rho-GTPase Regulation of Synergistic VEGF/CCL-18 Signaling. Frontiers in Oncology. 9, 456 (2019).
- Allen, S. G., et al. Macrophages Enhance Migration in Inflammatory Breast Cancer Cells via RhoC GTPase Signaling. Scientific Reports. 6, 39190 (2016).
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Chen, Y. C., et al. Single-cell Migration Chip for Chemotaxis-based Microfluidic Selection of Heterogeneous Cell Populations. Scientific Reports. 5, 9980 (2015).
- Choi, Y. P., et al. Cancer-associated fibroblast promote transmigration through endothelial brain cells in three-dimensional in vitro models. International Journal of Cancer. 135 (9), 2024-2033 (2014).
- Takeshita, Y., et al. An in vitro blood-brain barrier model combining shear stress and endothelial cell/astrocyte co-culture. Journal of Neuroscience Methods. 232, 165-172 (2014).
- Kienast, Y., et al. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nature Medicine. 16 (1), 116-122 (2010).
- Schroeder, W., Martin, K., Lorenson, B. . The Visualization Toolkit. 4th edn. , (2006).
- Wells, W. M., Grimson, W. L., Kikinis, R., Jolesz, F. A. Adaptive segmentation of MRI data. IEEE Transactions on Medical Imaging. 15 (4), 429-442 (1996).
- Agarwal, S. K., Singh, S., Ghuman, S. S., Sharma, S., Lahiri, A. K. Radiological assessment of the Indian children with congenital sensorineural hearing loss. International Journal of Otolaryngology. 2014, 808759 (2014).
- Mansfield, P., Maudsley, A. A. Medical imaging by NMR. The British Journal of Radiology. 50 (591), 188-194 (1977).
- Plewes, D. B., Kucharczyk, W. Physics of MRI: a primer. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 35 (5), 1038-1054 (2012).
- Batteux, C., Haidar, M. A., Bonnet, D. 3D-Printed Models for Surgical Planning in Complex Congenital Heart Diseases: A Systematic Review. Frontiers in Pediatrics. 7, 23 (2019).
- Thibault, F., et al. MRI for surgical planning in patients with breast cancer who undergo preoperative chemotherapy. American Journal of Roentgenology. 183 (4), 1159-1168 (2004).
- Oliver, C. R., et al. A platform for artificial intelligence based identification of the extravasation potential of cancer cells into the brain metastatic niche. Lab on a Chip. 19 (7), 1162-1173 (2019).
- Gril, B., et al. Reactive astrocytic S1P3 signaling modulates the blood-tumor barrier in brain metastases. Nature Communications. 9 (1), 2705 (2018).
- Badilescu, S., Packirisamy, M. . BioMEMS: Science And Engineering Perspectives. , (2011).
- Liu, C. . Foundations of MEMS. 2nd edn. , (2012).
- Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (muBBB). Lab on a Chip. 12 (10), 1784-1792 (2012).
- Lockman, P. R., et al. Heterogeneous blood-tumor barrier permeability determines drug efficacy in experimental brain metastases of breast cancer. Clinical Cancer Research. 16 (23), 5664-5678 (2010).
- Ryan Oliver, C., W, T. M. Con-tom: A Jupyter Notebook for Analyzing the tumor micro-environment in confocal images. Zenodo. , (2020).
- Lorensen, W. E., Johnson, C., Kasik, D., Whitton, M. C. History of the Marching Cubes Algorithm. IEEE Computer Graphics and Applications. 40 (2), 8-15 (2020).
- Kleinbaum, D. G., Kupper, L. L. . Applied regression analysis and other multivariable methods. , (1978).
- Berg, M. d. . Computational geometry : algorithms and applications, 2nd rev. edn. , (2000).
- Esch, M. B., Post, D. J., Shuler, M. L., Stokol, T. Characterization of in vitro endothelial linings grown within microfluidic channels. Tissue Engineering Part A. 17 (23-24), 2965-2971 (2011).
- Brinkley, B. R., et al. Variations in cell form and cytoskeleton in human breast carcinoma cells in vitro. 암 연구학. 40 (9), 3118-3129 (1980).
- Eigenmann, D. E., et al. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids and Barriers of the Central Nervous System. 10 (1), 33 (2013).
- Griep, L. M., et al. BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomedical Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).
- Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids and Barriers of the Central Nervous System. 10 (1), 16 (2013).
- Dello Russo, C., et al. The human microglial HMC3 cell line: where do we stand? A systematic literature review. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 259 (2018).
- Dun, M. D., et al. Proteotranscriptomic Profiling of 231-BR Breast Cancer Cells: Identification of Potential Biomarkers and Therapeutic Targets for Brain Metastasis. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (9), 2316-2330 (2015).
- Xing, F., et al. Reactive astrocytes promote the metastatic growth of breast cancer stem-like cells by activating Notch signalling in brain. EMBO Molecular Medicine. 5 (3), 384-396 (2013).
- Zhang, B., Radisic, M. Organ-on-a-chip devices advance to market. Lab on a Chip. 17 (14), 2395-2420 (2017).
