Summary

Blot ocidental de alta velocidade usando tecnologia de aprimoramento de imunoreaction

Published: September 26, 2020
doi:

Summary

Uma técnica de mancha ocidental de ultra-alta velocidade é desenvolvida melhorando a cinética da ligação antígeno-anticorpo através da tecnologia de drenagem e reposição cíclica (CDR) em conjunto com um agente de aumento de imunoreaction.

Abstract

Uma mancha ocidental (também conhecida como imunoblot) é um método canônico para pesquisa biomédica. É comumente usado para determinar o tamanho relativo e abundância de proteínas específicas, bem como modificações de proteína pós-translacional. Esta técnica tem uma rica história e permanece em uso generalizado devido à sua simplicidade. No entanto, o procedimento de mancha ocidental leva horas, até dias, para ser concluído, com um gargalo crítico sendo os longos tempos de incubação que limitam seu rendimento. Estas etapas de incubação são necessárias devido à lenta difusão de anticorpos da solução a granel para os antígenos imobilizados na membrana: a concentração de anticorpos perto da membrana é muito menor do que a concentração a granel. Aqui, apresentamos uma inovação que reduz drasticamente esses intervalos de incubação, melhorando a ligação de antígeno através da drenagem cíclica e reposição (CDR) da solução de anticorpos. Também utilizamos uma tecnologia de aprimoramento da imunoreação para preservar a sensibilidade do ensaio. Uma combinação do método CDR com um agente de aumento de imunoreaction comercial aumentou o sinal de saída e reduziu substancialmente o tempo de incubação de anticorpos. A mancha ocidental de ultra-alta velocidade resultante pode ser realizada em 20 minutos sem qualquer perda de sensibilidade. Este método pode ser aplicado a manchas ocidentais usando a detecção de chemiluminescente e fluorescente. Este protocolo simples permite que os pesquisadores explorem melhor a análise da expressão proteica em muitas amostras.

Introduction

Uma mancha ocidental (também conhecida como imunoblot) é uma técnica poderosa e fundamental em uma ampla gama de disciplinas científicas e clínicas. Esta técnica é usada para examinar a presença, abundância relativa, massa molecular relativa e modificações pós-translacionais de proteínas1. Combinado com a análise digital de imagens, este método pode analisar de forma confiável a abundância de proteínas e modificações proteicas2. Embora a mancha ocidental seja realizada rotineiramente, é um método demorado e intensivo em mão-de-obra. São necessárias longas incubações do anticorpo com membranas. Aqui, descrevemos uma modificação do método de incubação que supera essa limitação sem sacrificar a sensibilidade.

Durante a incubação da membrana, os anticorpos flutuam em solução enquanto os antígenos são imobilizados na membrana. Devido à sua alta afinidade, a taxa de ligação de anticorpos ao antígeno é mais rápida do que a difusão de anticorpos da solução a granel para a membrana. Isso cria uma baixa concentração “camada de esgotamento”(Figura 1). Pode levar horas para anticorpos mais distantes chegarem à membrana por meio da difusão passiva, que é o principal fator responsável por longos tempos de incubação nesta técnica. Esse efeito é chamado de limitação de transporte de massa (MTL)3. Foi proposto que a drenagem repetitiva e a reposição da solução contendo anticorpos podem interromper a camada de esgotamento e superar o MTL4. Aqui, elaboramos uma técnica única que implementa este conceito de drenagem e reposição cíclica (CDR) para diminuir o efeito do MTL em um protocolo tradicional de manchas ocidentais e comentou encurtar o período de incubação necessário.

Para manter a sensibilidade de detecção com um curto tempo de incubação, fizemos uso de uma tecnologia de aprimoramento da imunoreaction que acelera a reação de anticorpos de antígeno, melhorando assim a relação sinal-ruído5. Muitos agentes de imunoreação disponíveis comercialmente (IRE) consistem em 2 componentes (Solução 1 e 2, ver Tabela de Materiais). A composição proprietária ou mecanismo de ação do IRE não foi divulgada, mas descobrimos anteriormente que o IRE diminuiu a constante de dissociação entre o antígeno e o anticorpo em ensaios de ligação de fase sólida, indicando que o aumento da afinidade é, pelo menos em parte, responsável pelo efeito de aumento do IRE6. A combinação de CDR com IRE produz um protocolo de manchas ocidentais de ultra-alta velocidade que reduz todo o tempo de procedimento sem sacrificar a sensibilidade.

Protocol

1. SDS-PAGE e transferência para uma membrana PVDF Execute o SDS-PAGE para separar proteínas com base no tamanho relativo.NOTA: Qualquer sistema de gel comercial ou caseiro está bem. Por favor, siga o protocolo do fabricante. Transfira proteínas separadas de um gel para uma membrana PVDF.NOTA: Os métodos comuns de transferência (transferência semi-seca ou úmida) são adequados. Por favor, siga o protocolo do fabricante. 2. Bloqueio de membranas PVDF …

Representative Results

Este exemplo ilustra a eficácia do método CDR juntamente com a tecnologia de imunoenhancing na mancha ocidental. A incubação estática foi realizada em uma película flexível semi-transparente onde as membranas PVDF foram incubadas com a solução de anticorpos, enquanto a incubação da CDR estava em um forno de hibridização por tubos rotativos que continham as membranas e a solução de anticorpos (Movie). A Figura 2 mostrou quantidades de antígeno e anticorpo, respectivamente, nec…

Discussion

A mancha ocidental é uma técnica analítica amplamente utilizada para detectar proteínas específicas que foram desenvolvidas ~40 anos atrás7,8. Desde então, a técnica continuou a evoluir, com inovações subsequentes melhorando a sensibilidade, velocidade e quantitação da técnica2,9,10,11,12<…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pela Divisão de Pesquisa Intramuros, Instituto Nacional de Coração, Pulmão e Sangue, Institutos Nacionais de Saúde. A S.H. foi apoiada pelo Programa de Estudos de Estudantes de Parceria Público-Privada do Japão no Exterior, e H.N. e K.Y. foram pela Valor e V Drug Overseas Training Scholarship.

Materials

14 mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube, Graduated, with Snap Cap Falcon 352059
Apollo Transparency Film for Laser Printers N/A N/A Any kinds of Laser Printer Transparency Film are fine.
Azure Imaging System 600 Azure Biosystems Azure 600 Any kind of Image Acquiring Sytem is fine for chemiluminescent and/or fluorescent detection.
Can Get Signal Immunoreaction Enhancer Solution TOYOBO NKB-101
CARNATION Instant Nonfat Dry Milk Carnation N/A
ECL anti-mouse IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab’)2 fragment from sheep GE Healthcare NA9310V
ECL anti-rabbit IgG, Horseradish peroxidase linked F(ab’)2 fragment from donkey GE Healthcare NA9340V
HYBAID Micro-4 N/A N/A Any hybridization oven is fine as long as the tubes are rotated evenly at a horizontal position.
Immobilon-P PVDF Membrane, 0.45 µm pore size Millipore Sigma IPVH304F0
IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody LICOR 926-68070
IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody LICOR 926-32211
KPL LumiGLO Reserve Chemiluminescent Substrate seracare 5430-0049
Mouse anti-ß actin antibody Millipore Sigma A5316
Odyssey Blocking Buffer (PBS) LICOR 927-40100 Blocking Buffer for fluorescent detection
OXO Salad Spinner OXO 32480V2B Any salad spinner is fine as long as the PVDF membranes are rinsed vigorously without tear.
Parafilm Sealing Film Bemis Parafilm M PM996 semi-transparent flexible film
Polyethylene Flat-Top Screw Caps for 50 mL Conical Bottom Centrifuge Tubes Falcon 352070
Rings to hold 14 ml tube in the center of 50 ml tube N/A N/A Prepared in a machine shop
Rabbit anti-6X His tag antibody Abcam ab9108
Tween20 Millipore Sigma P2287

References

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Cite This Article
Higashi, S. L., Yagyu, K., Nagase, H., Pearson, C. S., Geller, H. M., Katagiri, Y. Ultra-High-Speed Western Blot using Immunoreaction Enhancing Technology. J. Vis. Exp. (163), e61657, doi:10.3791/61657 (2020).

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