Detta protokoll presenterar ett arbetsflöde för sub mm 2D-visualisering av flera labila oorganiska näringsämnen och förorenande solute arter med diffusiva gradienter i tunna filmer (DGT) kombinerat med masspektrometri imaging. Solute provtagning och högupplöst kemisk analys beskrivs i detalj för kvantitativ kartläggning av solutes i rhizosfären av terrestra växter.
Vi beskriver en metod för tvådimensionell (2D) visualisering och kvantifiering av fördelningen av labil (dvs. reversibelt adsorberat) oorganiskt näringsämne (t.ex. P, Fe, Mn) och föroreningar (t.ex. As, Cd, Pb) solute arter i jorden intill växtrötter (rhizosfären) vid sub millimeter (~ 100 μm) rumslig upplösning. Metoden kombinerar sink-baserad solute provtagning av diffusiva gradienter i tunna filmer (DGT) teknik med rumsligt löst kemisk analys genom laser ablation induktivt kopplade plasma massa spektrometri (LA-ICP-MS). DGT-tekniken är baserad på tunna hydrogeler med homogent fördelade analytselektiva bindningsfaser. Mångfalden av tillgängliga bindningsfaser möjliggör beredning av olika DGT-geltyper efter enkla geltillverkningsförfaranden. För utbyggnad av DGT-gel i rhizosfären odlas växter i platta, transparenta tillväxtbehållare (rhizotroner), vilket möjliggör minimal invasiv tillgång till ett jordodlat rotsystem. Efter en pre-growth period tillämpas DGT geler på utvalda regioner av intresse för in situ solute provtagning i rhizosfären. Därefter hämtas och bereds DGT-geler för efterföljande kemisk analys av de bundna solutformningarna med la-ICP-MS-linjeskanning. Tillämpning av intern normalisering med hjälp av 13C och extern kalibrering med hjälp av matrismatchade gelstandarder möjliggör ytterligare kvantifiering av 2D-soluteflödena. Denna metod är unik i sin förmåga att generera kvantitativa 2D-bilder av 2D-bilder av 2D-bilder med flera element i jord-växtmiljöer, vilket överträffar den uppnåeliga rumsliga upplösningen av andra metoder för att mäta lydiga lutningar i rhizosfären avsevärt. Vi presenterar tillämpningen och utvärderingen av metoden för avbildning flera katjoniska och anjoniska solute arter i rhizosfären av terrestra växter och belyser möjligheten att kombinera denna metod med kompletterande solute imaging tekniker.
Näringsförvärv av växtväxter är en nyckelfaktor för att bestämma grödans produktivitet. De processer som styr grödornas effektiva upptag av näringsämnen har studerats intensivt, särskilt de mekanismer som styr näringstillgången till och näringsin internalisering av växtrötter vid jordrotsgränssnittet, rhizosfären, är erkända för sin roll i växtnäringsförvärv. Viktiga processer för växtnäringsupptag inkluderar: näringstransport mot roten; Dynamisk sorptionsjämvikt mellan arter som löses upp i markens porvatten och arter som är bundna till fasta markytor. Mikrobiell konkurrens om näringsämnen. Mikrobiell mineralisering av näringsämnen som ingår i organiskt material i marken. och närings internalisering i rot symplasma. Upptaget av oorganiska spårmetaller (oid) föroreningar styrs till stor del av samma mekanismer.
Beroende på tillgången på näringsämnen och föroreningar, växtbehov och diffusivitet i jord kan differentierade näringsmönster i rhizosfären observeras. För starkt ssorberande element med jämförelsevis höga internaliseringshastigheter (t.ex. P, Fe, Mn, Zn, As, Cd, Pb), finns utarmning av labilen (dvs. reversibelt adsorberad) elementfraktion jämfört med bulkjorden, med utarmningszonbredder som ofta är ≤1 mm, medan för mer mobila näringsämnen som NR3–kan utarmningszoner sträcka sig upp till flera centimeter1. Dessutom har ackumulering av element som Al och Cd observerats när tillgängligheten överstiger upptaget av anläggningar2,3.
Med tanke på rhizosfärprocessernas betydelse för närings- och föroreningscykling har flera tekniker för att mäta den växt-tillgängliga elementfraktionen med hög rumslig upplösning utvecklats4,5. Att mäta småskaliga labila solutefördelningar har dock visat sig vara utmanande av flera skäl. En stor svårighet är att provta mycket små (lågt μL-intervall) volymer jord och/eller porvatten på definierade positioner intill levande växtrötter för att lösa de branta näringsgradienterna i rhizosfären. Ett tillvägagångssätt för att ta itu med detta problem är att använda mikrosugkoppar för utvinning av porvattenprover6. Med denna metod mätte A. Göttlein, A. Heim och E. Matzner7 jordporvatten näringskoncentrationer i närheten av Quercus robur L. rötter med en rumslig upplösning på ~ 1 cm. En svårighet att analysera μL-volymer jord- eller jordlösning är att dessa små provvolymer, i kombination med de låga koncentrationerna av alla utom de stora näringsarterna, kräver mycket känsliga kemiska analystekniker.
Ett alternativt system, som kan lösa näringsgradienter med en upplösning ner till ~ 0,5 mm, är att växa en rotmatta på ytan av ett jordblock, med ett tunt hydrofilt membranskikt som skiljer jord frånrötterna 8,9. I denna konfiguration kan solutes passera genom membranet och rötter kan ta upp näringsämnen och föroreningar från jorden medan rotutsöndrar kan sprida sig i jorden. Efter inrättandet av ett tätt rotskikt kan jordblocket provtas och skivas för att erhålla jordprover för efterföljande extraktion av elementfraktioner. På detta sätt kan endimensionella näringsämnen och förorenande gradienter, i genomsnitt över ett relativt stort område (~ 100 cm2) analyseras.
En annan utmaning är att få prover av labila, växt-tillgängliga elementfraktion, eftersom de flesta kemiska jordutvinningstekniker fungerar mycket annorlunda jämfört med de mekanismer genom vilka växter tar upp näringsämnen och föroreningar. I många jordutvinningsprotokoll blandas jord med en extraktiv lösning i syfte att fastställa en (pseudo-)jämvikt mellan upplöst och sorbat elementfraktion. Växter internaliserar dock kontinuerligt näringsämnen och utarmar därför ofta gradvis rhizosfärjorden. Även om jämviktsextraktionsprotokoll har antagits allmänt som marktester eftersom de är lätta att genomföra, representerar den extraherade näringsfraktionen ofta inte den växt tillgängliga näringsfraktionenväl 10,11,12,13. Sink metoder som kontinuerligt utarmar den provsmakade jorden för näringsämnen har föreslagits som fördelaktiga metoder och kan bättre likna den underliggande näringsupptagsmekanismen genom att efterlikna rotupptagsprocesserna10,11,14,15.
Utöver de metoder som beskrivs ovan har äkta bildåtergivningstillämpningar, som kan mäta kontinuerliga parameterkartor med upplösningar ≤100 μm över flera cm2, utvecklats för specifika element och jord (bio)kemiska parametrar5. Autoradiografi kan användas för att avbilda elementfördelningen i rhizosfären förutsatt att lämpliga radioisotoper finnstillgängliga 16. Planar optodes möjliggör visualisering av viktiga jordkemiska parametrar som pH och pO217,18,19, och enzymaktivitet eller totala proteinfördelningar kan kartläggas med fluorescerande indikatoravbildningstekniker som jord zymografi20,21,22,23 och/eller root blotting metoder24. Medan zymografi och autoradiografi är begränsade till mätning av en enda parameter i taget, kan pH och pO2 imaging med planar optodes göras samtidigt. De mer traditionella rotmattateknikerna ger endast 1D-information, medan mikrosugkoppar ger punktmätningar eller 2D-information med låg upplösning, men båda metoderna möjliggör flerelementsanalys. Mer nyligen presenterade P. D. Ilhardt , et al.25 ett nytt tillvägagångssätt med laserinducerad nedbrytningsspektroskopi (LIBS) för att kartlägga 2D totala multielementfördelningar med en upplösning på ~ 100 μm i jordrotskärnprover där den naturliga elementfördelningen bevarades genom noggrann provberedning.
Den enda teknik som kan rikta in sig på 2D-provtagning av flera närings- och föroreningssoluter med hög rumslig upplösning är diffusiva lutningar i tunnfilmsteknik (DGT), en diskbänksbaserad provtagningsmetod som immobiliserar labila spårmetallarter (loid) på plats på ett bindande material inbäddat i etthydrogelskikt 26,27. DGT introducerades som en kemisk speciationsteknik för att mäta labila solutes i sediment och vatten, och antogs snart för dess användning ijordar 28. Det möjliggör sub mm skala flera element solute imaging, som ursprungligen demonstrerades i en flod sediment29, och har utvecklats ytterligare för dess tillämpning i växt rhizosfärer30,31,32,33.
För DGT-provtagning appliceras ett gelark av en storlek på cirka 3 cm x 5 cm på en enda växtrot som växer i ytskiktet i ett jordblock, med ett hydrofilt membran som skiljer gelén från jorden. Under kontakttiden sprids labila näringsämnen och/eller föroreningar mot gelén och binds omedelbart av det bindningsmaterial som ingår i gelén. På detta sätt etableras ett koncentrationsgradient och därmed ett kontinuerligt nettoflöde mot gelén och råder under provtagningstiden. Efter provtagning kan hydrogelen avlägsnas och analyseras med hjälp av en analytisk kemisk teknik som möjliggör rumsligt löst analys. En högspecialiserad och ofta använd teknik för detta ändamål är laserablation induktivt kopplade plasma masspektrometri (LA-ICP-MS). I vissa tidiga studier användes också mikropartikelinducerade röntgenutsläpp (PIXE)29. DGT-provtagning i kombination med LA-ICP-MS-analys möjliggör kemisk avbildning med flera element med en rumslig upplösning på ~ 100 μm. Om mycket känsliga ICP-MS-tekniker (t.ex. sektorsområde ICP-MS) används kan exceptionellt låga detektionsgränser uppnås. I en studie om effekten av kalkning på Zn och Cd-upptag med majs15kunde vi kartlägga labila Cd i majs rhizosfären i oförorenad jord med en detektionsgräns på 38 pg cm-2 cd per gelområde. DGT, planar optodes och zymografi förlitar sig på diffusion av målelementet från jord till ett gelskikt, som kan utnyttjas för kombinerad tillämpning av dessa metoder för att samtidigt, eller i följd, avbilda ett stort antal parametrar som är relevanta för växtnäringsämne och förorenande upptag. Detaljerad information om analytiska kemiska aspekter av DGT-avbildning, om potentialen att kombinera DGT och andra bildframställningsmetoder och om dess tillämpningar granskas utförligt i ref.34,35.
I den här artikeln beskriver vi hur man utför ett solute imaging experiment med hjälp av DGT-tekniken på rötter av markbundna växter i en omättad markmiljö, inklusive växtodling, geltillverkning, gelapplikation, gelanalys och bildgenerering. Alla steg utarbetas i detalj, inklusive anteckningar om kritiska steg och experimentella alternativ.
Det solutbildande protokoll som presenteras här är en mångsidig metod för att visualisera och kvantifiera 2D-närings- och föroreningsflöde i jordväxtmiljöer. Det är unikt i sin förmåga att generera under mm skala flerelementsbilder av labila solute arter vid jord-rot gränssnittet, överstiger den uppnåeliga rumsliga upplösningen av alternativa metoder för att mäta solute gradienter i rhizosfären väsentligen4. DGT:s riktade in situ-provtagningsmetod, i kombination med en mycket känslig kemisk analysmetod såsom LA-ICP-MS, underlättar en detaljerad undersökning av den soluta flödesdynamiken kring enskilda växtrötter som odlas i jord eller liknande substrat. På grund av den sink-baserade provtagningsprocessen återspeglar de erhållna bilderna de visualiserade solutens lability och är därför en uppskattning av deras anläggningstillgänglighet10. Även om den metod-inneboende mätningen av solute fluxes har betydande fördelar som tolkningen som växt-tillgängliga näringsfraktioner, är flödesmätningar mycket mindre raka för att förstå än porvattenkoncentrationsmätningar. Standardprovtagningsgeometrin för DGT i bulkjordtillämpningar (särskilt de 0,8 mm tjocka diffusionsgeler som används i den inställningen) gör det möjligt att jämföra den faktiska porvattenkoncentrationen, csoln, och en tidsgenomsnittlig uppskattning av porvattenkoncentrationen genom en DGT-mätning i bulk, cDGT,och för tolkning av dessa parametrar avseende den återanskaffningsdynamiken hos en soluteart. En sådan jämförelse kan dock inte göras baserat på avbildning av DGT-applikation med mycket tunna diffusionsskikt, eftersom de härledda cDGT-värdena är orealistiskt små34. DGT-bildresultat är därför inte alltid enkla och snabba att tolka och är ofta inte direkt jämförbara med mer konventionella porvattenkoncentrationsmätningar.
Vid tillämpning av metoden måste några kritiska steg noggrant övervägas, främst relaterade till fyllning och vattning av rhizotrontillväxtbehållare. När du fyller jorden i rhizotronen är det mycket viktigt att undvika att komprimera jorden för mycket, eftersom växtrötterna inte kan tränga in i starkt komprimerad jord och rottillväxten kommer att hämmas. Vi har observerat rötter som undviker starkt komprimerad jord och växer längs rhizotrontillväxtbehållarens inre kanter, där jorden vanligtvis är mindre komprimerad. I det här fallet kan enskilda rötter som ligger i mitten av rhizotronerna, där DGT-geler kan appliceras bekvämt, inte utvecklas alls, vilket effektivt hämmar framgångsrik gelapplikation. I vårt laboratorium visade erfarenhet att torr jord bulk densiteter på 1,0-1,4 g cm-3 tillåter obehindrat rot utveckling. Dessutom är överdriven markkomprimering också en potentiell källa till artefakter när det gäller lösligheten hos redoxkänsliga element och biogeokemiskt associerade arter. Eftersom den totala porvolymen minskar och pordiameterfördelningen flyttas mot lägre diametrar i högkomprimerad jord, finns mindre luftfylld porvolym med större diameter tillgänglig, vilket kan leda till reduktiva förhållanden lokalt. Följaktligen kan MnIII/IV– och FeIII– oxider minskas, vilket leder till ökade Mn2 + och Fe2 + flödet. Upplösningen av Fe-oxider, som är viktiga sorptionsplatser, t.ex. för fosfat och mikronäringsämnen, kan frigöra sorkade och/eller samfällda arter och därmed orsaka artificiellt förhöjda flödet av den biogeokemiskt associerade arten. En liknande fråga kan uppstå om tillväxtbehållarna vattnas för mycket. Avdunstning via den lilla markytan högst upp i tillväxtbehållaren är låg och jorden kan förbli vattenmättad i upp till flera veckor efter plantering, vilket också kan orsaka redox artefakter.
En annan viktig faktor är den kemiska funktionaliteten hos den tillverkade HR-DGT-bindningsgelen. Genom att följa protokollet erhålls tunna geler med en homogen fördelning av bindningsfaser. Om gelerna har områden med inhomogen materialfördelning (t.ex. hål i gelen eller aggregat av bindningsfaser) måste dessa områden avlägsnas eller, om det är för omfattande, geltillverkningsprotokollet upprepas. Om gelen bereds korrekt måste den kunna binda målsoluta arter som sprider sig till gelén omedelbartoch kvantitativt 27, vilket bestäms av den analytspecifika gelbindningskapaciteten. Även om det är mindre problematiskt att överskrida gelkapaciteten i oförorenade jordar, bör den övervägas i metallförorenade jordar och saltlösningsjordmiljöer. Mättnad av gelbindningsfaserna kommer inte bara att försämra kvantitativ soluteprovtagning, men resulterar också i lateral diffusion av solutes mellan bindningsfaser i gelén, vilket leder till en obestämd lokalisering av småskaliga soluteflödesfunktioner. Om mycket stora mängder labila näringsämnen/främmande arter förväntas i måljordmiljön bör därför preliminära tester utföras. För uppskattning av förväntade DGT-belastningar kan DGT-kolvprovtagning i bulkjord följt av gelelutspädning och våtkemisk analys tillämpas15,49. Vid behov kan DGT-driftsättningstiderna justeras för att minska gelkontakttiden och därmed undvika gelmättnad över kapacitetströsklar. Omvänt kan preliminära tester också vara till hjälp för att identifiera erforderliga gelkontakttider och/eller LA-ICP-MS-känsligheter om mycket låga solutebelastningar förväntas, vilket kan vara viktigt för kartläggning av spårämnen på naturliga jordbakgrundsnivåer15. Dessutom bör korrekt DGT-gelfunktion kontrolleras före dess experimentella applicering genom kontrollerad lastning av geler vid beredning av DGT LA-ICP-MS kalibreringsstandarder. Gelstandarden ger en matrismatchad referensgelanalytbelastning som kan användas för att bedöma om provgelbelastningen som bestäms av LA-ICP-MS ligger inom det förväntade intervallet. Om det inte går att få fram en signal som skiljer sig från det tomma bakgrundsljudet från gasen och metoden, skall verksamhetsutövaren se till att laboratorieförfaranden för analys av spårämnen har genomförts och att alla protokollsteg har utförts korrekt. Ibland vänds DGT-gelén av misstag efter soluteprovtagning med den jordexponerade, laddade sidan vänd mot glasplattan snarare än laserstrålen, vilket resulterar i låga signalintensiteter och felaktigt vända funktioner i de slutliga solutflödesbilderna.
Under LA-ICP-MS-analysen genereras en stor mängd data, vilket tar lång tid att utvärdera. I vårt labb använder vi interna datautvärderingsskript som är skräddarsydda för vårt måldatautmatningsformat med hjälp av standardprogram för kalkylblad. Efter halvautomatisk sortering och kalibrering utförs bildritning med öppen källkod, open access-bildanalysverktyg (ImageJ, Fiji50). Den här metoden ger full kontroll över data sortering, utvärdering och presentation, vilket är viktigt eftersom de insamlade data motsvarar rektangulära och inte kvadratiska pixlar, som måste visas korrekt i de genererade solute kartorna. Under databehandlingen bör dessutom alla pixelinterpolationer undvikas noggrant. Pixelinterpolering leder till utjämnade gradienter i de kemiska bilderna, vilket resulterar i mjukade, ofta cirkulära elementfördelningsfunktioner och är därför en oönskad ändring av originaldata. Pixelinterpolering är en standardprocedur för omskalning och omformatering av åtgärder i många bildbehandlingsprogramprodukter men kan avmarkeras vanligtvis.
Sammanfattningsvis är den beskrivna metoden ett betydande framsteg för att förstå närings- och föroreningsdynamiken i naturliga jord-rhizosfär-växtsystem. Förutom DGT-endast applikationer kan metoden kombineras med andra diffusionsbaserade bildtekniker som planar optodes3,33,42,43,48,51 ochzymography20 , 21,22,23,24, och kan utvecklas ytterligare för att inkludera ytterligare element och markparametrar.
The authors have nothing to disclose.
Denna studie samfinansierades av Den österrikiska vetenskapsfonden (FWF): P30085-N28 (Thomas Prohaska) och Österrikiska vetenskapsfonden (FWF) och den federala staten Nedre Österrike: P27571-BBL (Jakob Santner).
(NH4)2S2O8 (ammonium persulfate; APS) | VWR | 21300.260 | ≥98.0%, analytical reagent |
2-(N-morpholino)-ethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M8250-100G | ≥99.5% |
Acrylamide solution | Sigma-Aldrich | A4058-100ML | 40%, for electrophoresis |
Analyte salts | n/a | n/a | Use water soluble analyte salts of analytical grade or higher |
Buechner funnel | VWR | 511-0065 | 13 cm plate diameter |
Chemical equilibrium modelling software | KTH Sweden | n/a | Visual MINTEQ |
Clamp | Local warehouse | n/a | |
Desktop publishing software | Adobe Inc. | n/a | InDesign CS6 |
DGT cross-linker | DGT Research Ltd | n/a | 2%, agarose derivative |
DGT piston sampler | DGT Research Ltd | n/a | 2 cm diameter exposure window |
Digital single-lens reflex (DSLR) camera | Canon Inc. | n/a | Canon EOS 1000D |
Dispersion device | IKA | 3737000 | Ultra-Turrax T10 Basic |
Double-sided adhesive tape | Tesa | 56171 | |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 34923 | Puriss. p.a., absolute, ≥99.8% |
Gel blotting paper | Whatman | 10426981 | Blotting Papers, Grade GB005, 20 × 20 cm, 1.5 mm thickness |
Gel drier | UniEquip | n/a | UNIGELDRYER 3545 |
High-pressure microwave system | Anton Paar | n/a | Multiwave 3000 |
HNO3 | VWR | 1.00456.2500P | 65%, ISO for analysis |
Horizontal shaker | GFL | 305 | |
HydroMed D4 | AdvanSource Biomaterials Corp. | n/a | Ether-based hydrophilic urethane |
ICP-MS software | Perkin Elmer | n/a | Syngistix |
Image analysis software | National Institutes of Health (NIH) | n/a | ImageJ Fiji, freely available at https://fiji.sc/ |
Knife-coating device | BYK | 5561 | Single Bar 6″, 0.5 mils |
LA software | Elemental Scientific Lasers | n/a | ActiveView |
LA system | Elemental Scientific Lasers | n/a | NWR193 |
Laminar flow bench | Telstar Laboratory Equipment B.V. | n/a | Class II biological safety cabinet |
Magnetic stirrer | IKA | 0003582400 | C-MAG MS 7 |
Moisture-retaining film | Bemis Company, Inc. | PM999 | Parafilm M, 4" x 250' |
N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281-50ML | BioReagent, suitable for electrophoresis, ~99% |
NaNO3 | Sigma-Aldrich | 229938-10G | 99.995% trace metals basis |
NaOH | Sigma-Aldrich | 1064980500 | Pellets for analysis |
Overhead shaker | GFL | 3040 | |
Perfluoroalkoxy alkane (PFA) vials | Savillex | 200-015-20 | 15 mL Standard Vial, Rounded Interior |
pH meter | Thermo Scientific | 13-644-928 | Orion 3-Star Benchtop pH Meter |
pH probe | Thermo Scientific | 8157BNUMD | Orion ROSS Ultra pH/ATC Triode |
Plastic cutter | DGT Research Ltd | n/a | Use empty cross-linker vials from DGT research Ltd |
Plastic tweezers | Semadeni | 602 | |
Plasticine | Local stationary shop | n/a | non-drying plastic modelling mass based on paraffin wax and bulking agents |
Polycarbonate membrane discs | Whatman | 110606 | Nuclepore Hydrophilic Membrane, 25 mm diameter, 0.2 µm pore size, 10 µm thickness |
Polycarbonate membrane sheet | Whatman | 113506 | Nuclepore Hydrophilic Membrane, 8 × 10 in, 0.2 µm pore size, 10 µm thickness |
Polyethersulfone membrane discs | Pall Corporation | 60172 | Supor 450 Membrane Disc Filters, 25 mm diameter, 0.45 µm pore size, 0.14 mm thickness |
Polyethersulfone membrane sheet | Pall Corporation | 60179 | Supor 450 Membrane Disc Filters, 293 mm diameter, 0.45 µm pore size, 0.14 mm thickness |
PTFE foil | Haberkorn | n/a | 50 µm thickness |
PTFE spacer | Haberkorn | n/a | Variable thicknesses available |
PTFE-coated razor blades | Personna GEM | 62-0178 | Stainless steel single edge blades (coated) |
PTFE-coated Tygon tubing | S-prep GmbH | SP8180 | 0.32 cm inner diameter |
Quadrupole ICP-MS | Perkin Elmer | N8150044 | NexION 2000B |
Quantitative filter paper, 454 | VWR | 516-0854 | Particle retention 12-15 µm |
Spreadsheet software | Microsoft Corporation | n/a | Microsoft Excel 2016 (v16.0) |
Stainless-steel cutter | Local locksmithery | n/a | 2.5 cm diameter |
Suspended particulate reagent-iminodiacetate (SPR-IDA) | Teledyne CETAC Technologies | n/a | 10 µm diameter polystyrene beads, 10 % (w/v) bead suspension |
Transistor-transistor logic (TTL) cable | n/a | n/a | Consult ICP-MS technician to identify a suitable TTL cable for a specific instrument |
Two-volume cell | Elemental Scientific Lasers | n/a | Two-volume cell 1 |
Vinyl electrical tape | 3M | n/a | Scotch Super 33+ |
Water purification system | Termo Electron LED GmbH | n/a | TKA-GenPure |
ZrOCl2 × 8H2O | Alfa Aesar | 86108.30 | 99.9 %, metals basis |