خلية واحدة Electroporation عبر مختلف الثقافة شريحة Organotypic من الإثارة فرس النهر الماوس والخلايا العصبية المثبطة فئة محددة
Summary
يقدم هنا بروتوكول للكهرومporation أحادي الخلية التي يمكن أن توفر الجينات في كل من الخلايا العصبية مثير ومثبطة عبر مجموعة من الأعمار ثقافة شريحة فرس النهر في المختبر. يوفر نهجنا تعبيرا دقيقا وفعالا عن الجينات في الخلايا الفردية ، والتي يمكن استخدامها لفحص الوظائف المستقلة للخلايا وبين الخلايا.
Abstract
وقد أثبت الكهربوجين نفسه كطريقة حاسمة لنقل جينات محددة إلى خلايا لفهم وظيفتها. هنا، ونحن نصف تقنية الكهرومporation خلية واحدة أن يزيد من كفاءة (~ 80٪) من العدوى الجينية في المختبر في الخلايا العصبية المثبطة مثير وفئة محددة في ثقافة شريحة فرس النهر الجهازية الماوس. باستخدام أقطاب زجاجية كبيرة، السائل النخاعي الاصطناعي المحتوي على التيترودوتوشين والبقوليات الكهربائية الخفيفة، قدمنا جين ا مهما في الخلايا العصبية الهرمية المثقفة من فرس النهر CA1 والخلايا العصبية المثبطة. وعلاوة على ذلك، يمكن إجراء الكهرومporation في شرائح فرس النهر المستزرعة تصل إلى 21 يوما في المختبر مع عدم وجود انخفاض في كفاءة العدوى، مما يسمح لدراسة مراحل مختلفة زراعة شريحة التنمية. مع تزايد الاهتمام بدراسة الوظائف الجزيئية للجينات عبر مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا ، توضح طريقتنا نهجا موثوقا ومباشرا لإصابة الجينات المختبرية في أنسجة دماغ الماوس التي يمكن إجراؤها باستخدام معدات وتقنيات الفيزيولوجيا الكهربية الحالية.
Introduction
في البيولوجيا الجزيئية، أحد أهم الاعتبارات للمحقق هو كيفية تقديم جين مهم إلى خلية أو مجموعة من الخلايا لتوضيح وظيفتها. يمكن تصنيف طرق التسليم المختلفة إما بيولوجية (على سبيل المثال، ناقل فيروسي)، أو مادة كيميائية (مثل فوسفات الكالسيوم أو الدهون)، أو فيزيائية (مثل الكهرومporation، أو الميكرويكشن، أو الليسيتيك الحيوي)1،2. الأساليب البيولوجية هي فعالة للغاية ويمكن أن تكون خلية نوع محدد ولكن محدودة من خلال تطوير أدوات وراثية محددة. النهج الكيميائية قوية جدا في المختبر، ولكن الترافيكتوفيكات عشوائية عموما. علاوة على ذلك، يتم حجز هذه النهج في الغالب للخلايا الأساسية فقط. من النهج الفيزيائية ، biolistics هو أبسط وأسهل من وجهة نظر تقنية ، ولكن مرة أخرى تنتج نتائج العدوى العشوائية بكفاءة منخفضة نسبيا. للتطبيقات التي تتطلب نقل إلى خلايا محددة دون الحاجة إلى تطوير الأدوات الوراثية، ونحن نتطلع نحو كهربائية خلية واحدة3،4.
في حين أن الكهرومporation المستخدمة للإشارة فقط إلى الكهرومporation الميداني ، على مدى السنوات العشرين الماضية ، تم تطوير بروتوكولات متعددة في المختبر وفي الجسم الحي للكهرومporation أحادي الخلية لتحسين التحديد والكفاءة5و6و7، مما يدل على أنه يمكن استخدام الكهرومporation لنقل الجينات إلى خلايا فردية ، وبالتالي ، يمكن أن يكون دقيقا للغاية. ومع ذلك، فإن الإجراءات صعبة تقنيا، وتستغرق وقتا طويلا، وغير فعالة نسبيا. في الواقع ، حققت أوراق أحدث في جدوى منصات الكهرومporation الآلية8،9 ، والتي يمكن أن تساعد في إزالة العديد من هذه الحواجز للمحققين المهتمين بتركيب مثل هذهالروبوتات. ولكن بالنسبة لأولئك الذين يبحثون عن وسائل أبسط، فإن مشاكل الصعق الكهربائي، أي موت الخلايا، وفشل العدوى، وانسداد الماصة، لا تزال مصدر قلق.
لقد طورنا مؤخرا طريقة للتكهربائية تستخدم ماصة زجاجية ذات رؤوس أكبر، معلمات نبض كهربائي أكثر اعتدالا، وخطوة فريدة من نوعها ركوب الدراجات الضغط، والتي ولدت كفاءة العدوى أعلى بكثير في الخلايا العصبية مثير من الأساليب السابقة، ومكننا للمرة الأولى لtransfect الجينات في interneurons المثبطة، بما في ذلك الخلايا الداخلية المثبطة التعبير عن سوماتوستاتين في منطقة CA1 فرس النهر من ثقافة شريحة العضوية الماوس10. ومع ذلك ، لم يتم تناول موثوقية طريقة الكهربوين في أنواع مختلفة من الخلايا العصبية ومراحل نمو الخلايا العصبية. هنا، أثبتنا أن تقنية الكهربوئة هذه قادرة على نقل الجينات إلى كل من الخلايا العصبية المثيرة وفئات مختلفة من الخلايا الداخلية. الأهم من ذلك، كانت كفاءة العدوى عالية بغض النظر عن الأيام في المختبر (DIV) شريحة العمر الثقافة اختبارها. يوصى بشدة بهذه التقنية الراسخة والصديقة للمستخدم لأي محقق مهتم باستخدام الكهرومporation أحادي الخلية لأنواع مختلفة من الخلايا في سياق أنسجة دماغ الماوس المختبري.
Protocol
Representative Results
Discussion
نحن نصف هنا طريقة الكهرومporation التي تنقل كل من الخلايا العصبية المثيرة والمثبطة بكفاءة عالية ودقة. لدينا بروتوكول الكهربوجين الأمثل لديه ثلاثة اختراقات مبتكرة لتحقيق نقل الجينات عالية الكفاءة. وكان التعديل الأول لزيادة حجم ماصة مقارنة مع البروتوكولات المنشورة سابقا3،<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للمنح الصحية (R01NS085215 إلى K.F. و T32 GM107000 و F30MH122146 إلى A.C). 11- يشكر أصحاب البلاغ السيدة ناو واتانابي على المساعدة التقنية الماهرة.
Materials
| Plasmid preparation | |||
| Plasmid Purification Kit | Qiagen | 12362 | |
| Organotypic slice culture preparation | |||
| 6 Well Plates | GREINER BIO-ONE | 657160 | |
| Dumont #5/45 Forceps | FST | #5/45 | Angled dissection forceps for organotypic slice culture preparation |
| Flask Filter Unit | Millipore | SCHVU02RE | Filtration and storage of culture media |
| Incubator | Binder | BD C150-UL | |
| McIlwain Tissue Chopper | TED PELLA, INC. | 10180 | Tissue chopper for organotypic slice culture preparation |
| Millicell Cell Culture Insert, 30 mm | Millipore | PIHP03050 | Organotypic slice culture inserts |
| Osmometer | Precision Systems | OSMETTE II | |
| PTFE coated spatulas | Cole-Parmer | SK-06369-11 | |
| Scissors | FST | 14958-09 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Sterile Vacuum Filtration System | Millipore | SCGPT01RE | Filtration and storage of aCSF |
| Electrode preparation | |||
| Capillary Glasses | Warner Instruments | 640796 | |
| Micropipetter Puller | Sutter Instrument | P-1000 | Puller |
| Oven | Binder | BD (E2) | |
| Puller Filament | Sutter Instrument | FB330B | Puller |
| Single-cell electroporation and fluorescence imaging #1 | |||
| 3.5 mm Falcon Petri Dishes | BD Falcon | 353001 | |
| Airtable | TMC | 63-7512E | |
| CCD camera | Q Imaging | Retiga-2000DC | Camera |
| Electroporation System | Molecular Devices | Axoporator 800A | Electroporator |
| Fluorescence Illumination System | Prior | Lumen 200 | |
| Manipulator | Sutter Instrument | MPC-385 | Manipulator |
| Metamorph software | Molecular Devices | Image acquisition | |
| Peristaltic Pump | Rainin | Dynamax, RP-2 | Perfusion pump |
| Shifting Table | Luigs & Neuman | 240 XY | |
| Speaker | Unknown | Speakers connected to the electroporator | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ30 | |
| Table Top Incubator | Thermo Scientific | MIDI 40 | |
| Upright Microscope | Olympus | BX61WI | |
| Fluorescence imaging #2 | |||
| All-in-One Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X710 |
References
- Washbourne, P., McAllister, A. K. Techniques for gene transfer into neurons. Current Opinion in Neurobiology. 12 (5), 566-573 (2002).
- Capecchi, M. R. High efficiency transformation by direct microinjection of DNA into cultured mammalian cells. Cell. 22 (2), 479-488 (1980).
- Rae, J. L., Levis, R. A. Single-cell electroporation. Pflugers Archives: European Journal of Physiology. 443 (4), 664-670 (2002).
- Teruel, M. N., Blanpied, T. A., Shen, K., Augustine, G. J., Meyer, T. A versatile microporation technique for the transfection of cultured CNS neurons. Journal of Neuroscience Methods. 93 (1), 37-48 (1999).
- Rathenberg, J., Nevian, T., Witzemann, V. High-efficiency transfection of individual neurons using modified electrophysiology techniques. Journal of Neuroscience Methods. 126 (1), 91-98 (2003).
- Tanaka, M., Yanagawa, Y., Hirashima, N. Transfer of small interfering RNA by single-cell electroporation in cerebellar cell cultures. Journal of Neuroscience Methods. 178 (1), 80-86 (2009).
- Wiegert, J. S., Gee, C. E., Oertner, T. G. Single-Cell Electroporation of Neurons. Cold Spring Harbor Protocols. 2017 (2), 094904 (2017).
- Li, L., et al. A robot for high yield electrophysiology and morphology of single neurons in vivo. Nature Communication. 8, 15604 (2017).
- Steinmeyer, J. D., Yanik, M. F. High-throughput single-cell manipulation in brain tissue. PLoS One. 7 (4), 35603 (2012).
- Keener, D. G., Cheung, A., Futai, K. A highly efficient method for single-cell electroporation in mouse organotypic hippocampal slice culture. Journal of Neuroscience Methods. 337, 108632 (2020).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Ibata, K., Sun, Q., Turrigiano, G. G. Rapid synaptic scaling induced by changes in postsynaptic firing. Neuron. 57 (6), 819-826 (2008).
- Li, Y., et al. Electroporation on microchips: the harmful effects of pH changes and scaling down. Science Reports. 5, 17817 (2015).
- Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. Journal of Neuroscience. 30 (18), 6171-6177 (2010).
- Taverna, E., Haffner, C., Pepperkok, R., Huttner, W. B. A new approach to manipulate the fate of single neural stem cells in tissue. Nature Neurosciences. 15 (2), 329-337 (2011).
- Zhang, Y., Yu, L. C. Single-cell microinjection technology in cell biology. Bioessays. 30 (6), 606-610 (2008).
- De Simoni, A., Griesinger, C. B., Edwards, F. A. Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity. Journal of Physiology. 550, 135-147 (2003).
