Elettroporazione a cella singola attraverso diverse culture di fette organotipiche di neuroni eccitatori ippocampali del topo e specifici della classe
Summary
Presentato qui è un protocollo per l’elettroporazione a singola cellula in grado di fornire geni sia nei neuroni eccitatori che inibitori in una vasta gamma di età della coltura di fette ippocampali in vitro. Il nostro approccio fornisce un’espressione precisa ed efficiente dei geni nelle singole cellule, che può essere utilizzata per esaminare le funzioni cellulari autonome e intercellulari.
Abstract
L’elettroporazione si è affermata come un metodo critico per trasferire geni specifici nelle cellule per comprenderne la funzione. Qui descriviamo una tecnica di elettroporazione a una cellula che massimizza l’efficienza (~80%) della trasfezione genica in vitro nei neuroni inibitori eccitatori e specifici della classe nella coltura di fette ippocampali organotipiche del topo. Utilizzando grandi elettrodi di vetro, liquido cerebrospinale artificiale contenente tetrodotossine e impulsi elettrici lievi, abbiamo fornito un gene di interesse in neuroni piramidali CA1 ippocampali coltivati e internauri inibitori. Inoltre, l’elettroporazione potrebbe essere effettuata in fette ippocampali coltivate fino a 21 giorni in vitro senza alcuna riduzione dell’efficienza di trasfezione, consentendo lo studio di varie fasi di sviluppo della coltura delle fette. Con l’interesse crescente nell’esaminare le funzioni molecolari dei geni in una vasta gamma di tipi di cellule, il nostro metodo dimostra un approccio affidabile e diretto alla trasfezione genica in vitro nel tessuto cerebrale del topo che può essere eseguita con le apparecchiature e le tecniche di elettrofisiologia esistenti.
Introduction
In biologia molecolare, una delle considerazioni più importanti per uno studio è come fornire un gene di interesse in una cellula o popolazione di cellule per chiarire la sua funzione. I diversi metodi di somministrazione possono essere classificati come biologici (ad esempio, un vettore virale), chimici (ad esempio, fosfato di calcio o lipidi) o fisici (ad esempio, elettroporazione, microiniezione o biolistici)1,2. I metodi biologici sono altamente efficienti e possono essere specifici del tipo cellulare, ma sono limitati dallo sviluppo di specifici strumenti genetici. Gli approcci chimici sono molto potenti in vitro, ma le trasfettenze sono generalmente casuali; inoltre, questi approcci sono per lo più riservati solo alle cellule primarie. Tra gli approcci fisici, la biolistica è la più semplice e semplice da un punto di vista tecnico, ma ancora una volta produce risultati di trasfezione casuali con un’efficienza relativamente bassa. Per applicazioni che richiedono il trasferimento in cellule specifiche senza la necessità di sviluppare strumenti genetici, guardiamo all’elettroporazione asingola cella 3,4.
Mentre l’elettroporazione si riferiva solo all’elettroporazione sul campo, negli ultimi vent’anni sono stati sviluppati protocolli multipli di elettroporazione a singola cella in vitro e in vivo per migliorare laspecificità e l’efficienza 5,6,7, dimostrando che l’elettroporazione può essere utilizzata per trasferire geni a singole cellule e può quindi essere estremamente precisa. Tuttavia, le procedure sono tecnicamente impegnative, dispendiose in termini di tempo e relativamente inefficienti. In effetti, documenti più recenti hanno studiato la fattibilità dei carri meccanizzati di elettroporazione8,9, che possono aiutare ad eliminare molte di queste barriere per gli investigatori interessati all’installazione di tale robotica. Ma per coloro che cercano mezzi più semplici, i problemi con l’elettroporazione, vale a dire la morte cellulare, il fallimento della trasfezione e l’intasamento delle pipette, rimangono una preoccupazione.
Recentemente abbiamo sviluppato un metodo di elettroporazione che utilizza pipette di vetro con punta più grande, parametri di impulsi elettrici più lievi e un passaggio di ciclo della pressione unico, che ha generato un’efficienza di trasfezione molto più elevata nei neuroni eccitatori rispetto ai metodi precedenti, e ci ha permesso per la prima volta di trasfetto geni in internauri inibitori, tra cui internauri inibitori che esprimono somatostatina nella regione ippocampale CA1 della coltura organotipica del topo10. Tuttavia, l’affidabilità di questo metodo di elettroporazione in diversi tipi di internauron inibitori e stadi di sviluppo neuronale non è stata affrontata. Qui, abbiamo dimostrato che questa tecnica di elettroporazione è in grado di trasfetto i geni sia nei neuroni eccitatori che in diverse classi di internauri. È importante sottolineare che l’efficienza della trasfezione era elevata indipendentemente dai giorni in vitro (DIV) di coltura delle fette testate. Questa tecnica consolidata e di facile utilizzo è altamente raccomandata a qualsiasi ricercatore interessato a utilizzare l’elettroporazione a singola cellula per diversi tipi di cellule nel contesto del tessuto cerebrale del topo in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Descriviamo qui un metodo di elettroporazione che trasfetta sia i neuroni eccitatori che inibitori con alta efficienza e precisione. Il nostro protocollo di elettroporazione ottimizzato ha tre innovazioni innovative per ottenere una trasfezione genica altamente efficiente. La nostra prima modifica è stata l’aumento delle dimensioni delle pipette rispetto ai protocolliprecedentemente pubblicati 3,5,6. Questo cambiamento ci ha pe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da National Institutes of Health Grants (da R01NS085215 a K.F., T32 GM107000 e F30MH122146 ad A.C.). Gli autori ringraziano la signora Naoe Watanabe per l’abile assistenza tecnica.
Materials
| Plasmid preparation | |||
| Plasmid Purification Kit | Qiagen | 12362 | |
| Organotypic slice culture preparation | |||
| 6 Well Plates | GREINER BIO-ONE | 657160 | |
| Dumont #5/45 Forceps | FST | #5/45 | Angled dissection forceps for organotypic slice culture preparation |
| Flask Filter Unit | Millipore | SCHVU02RE | Filtration and storage of culture media |
| Incubator | Binder | BD C150-UL | |
| McIlwain Tissue Chopper | TED PELLA, INC. | 10180 | Tissue chopper for organotypic slice culture preparation |
| Millicell Cell Culture Insert, 30 mm | Millipore | PIHP03050 | Organotypic slice culture inserts |
| Osmometer | Precision Systems | OSMETTE II | |
| PTFE coated spatulas | Cole-Parmer | SK-06369-11 | |
| Scissors | FST | 14958-09 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Sterile Vacuum Filtration System | Millipore | SCGPT01RE | Filtration and storage of aCSF |
| Electrode preparation | |||
| Capillary Glasses | Warner Instruments | 640796 | |
| Micropipetter Puller | Sutter Instrument | P-1000 | Puller |
| Oven | Binder | BD (E2) | |
| Puller Filament | Sutter Instrument | FB330B | Puller |
| Single-cell electroporation and fluorescence imaging #1 | |||
| 3.5 mm Falcon Petri Dishes | BD Falcon | 353001 | |
| Airtable | TMC | 63-7512E | |
| CCD camera | Q Imaging | Retiga-2000DC | Camera |
| Electroporation System | Molecular Devices | Axoporator 800A | Electroporator |
| Fluorescence Illumination System | Prior | Lumen 200 | |
| Manipulator | Sutter Instrument | MPC-385 | Manipulator |
| Metamorph software | Molecular Devices | Image acquisition | |
| Peristaltic Pump | Rainin | Dynamax, RP-2 | Perfusion pump |
| Shifting Table | Luigs & Neuman | 240 XY | |
| Speaker | Unknown | Speakers connected to the electroporator | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ30 | |
| Table Top Incubator | Thermo Scientific | MIDI 40 | |
| Upright Microscope | Olympus | BX61WI | |
| Fluorescence imaging #2 | |||
| All-in-One Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X710 |
References
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