マウス海馬興奮性およびクラス特異的阻害ニューロンの異なるorganotypics Slice培養における単細胞エレクトロポレーション
Summary
ここで提示される単細胞エレクトロポレーションのためのプロトコルは、体外海馬スライス培養年代の範囲にわたって興奮性および阻害性ニューロンの両方の遺伝子を送達することができる。このアプローチは、細胞自律機能や細胞間機能を調べるために使用できる個々の細胞内の遺伝子の正確かつ効率的な発現を提供します。
Abstract
エレクトロポレーションは、特定の遺伝子を細胞に移してその機能を理解するための重要な方法としての確立を確立しました。ここでは、マウスの組織性海馬スライス培養における興奮性およびクラス特異的阻害ニューロンにおけるインビトロ遺伝子トランスフェクションの効率(約80%)を最大化する単細胞エレクトロポレーション技術について述べている。大きなガラス電極、テトロドトキシン含有人工脳脊髄液および軽度の電気パルスを用いて、培養海馬CA1錐体ニューロンおよび阻害性インターニューロンに関心のある遺伝子を送達した。さらに、エレクトロポレーションは、トランスフェクション効率の低下を伴う21日間までの培養海馬スライスで行うことができ、様々なスライス培養の発達段階の研究を可能にする。多様な細胞型にわたって遺伝子の分子機能を調べることに関心が高まる中、既存の電気生理学装置や技術で行うことができるマウス脳組織におけるインビトロ遺伝子トランスフェクションに対する信頼できる簡単なアプローチを実証しています。
Introduction
分子生物学では、研究者にとって最も重要な考慮事項の1つは、その機能を解明するために細胞または細胞の集団に関心のある遺伝子を送達する方法です。異なる送達方法は、生物学的(例えば、ウイルスベクター)、化学的(例えば、リン酸カルシウムまたは脂質)、または物理的(例えば、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、またはバイオリストクス)1、2のいずれかに分類することができる。生物学的方法は高効率で、細胞種に特異的であるが、特定の遺伝的ツールの開発によって制限される。化学アプローチは、インビトロでは非常に強力ですが、トランスフェクションは一般的にランダムです。さらに、これらのアプローチは主にプライマリセル専用です。物理的アプローチの中で、バイオリスティクスは技術的な観点から最も簡単で最も簡単ですが、再び比較的低い効率でランダムトランスフェクション結果を生成します。遺伝的ツールを開発する必要なく特定の細胞への転送を必要とするアプリケーションについては、単一細胞エレクトロポレーション3、4に目を向けます。
エレクトロポレーションはフィールドエレクトロポレーションのみを指していたのに対し、過去20年間に、特異性と効率を向上させるために複数のin vitroおよびin vivo単一細胞エレクトロポレーションプロトコルが開発され、エレクトロポレーションが遺伝子を個々の細胞に移すことができることを実証し、したがって、非常に正確であることが実証されています。しかし、この手順は技術的に要求が厳しく、時間がかかり、比較的非効率的です。実際、最近の論文では、機械化されたエレクトロポレーションリグ8,9の実現可能性を調査しており、このようなロボット工学の設置に興味を持つ研究者にとってこれらの障壁のいくつかを排除するのに役立ちます。しかし、より単純な手段を探している人にとって、エレクトロポレーション、すなわち細胞死、トランスフェクション障害、ピペット詰まりの問題は依然として懸念される。
我々は最近、より大きな先端ガラスピペット、穏やかな電気パルスパラメータ、および以前の方法よりもはるかに高い経道ニューロンのトランスフェクション効率を生成するユニークな圧力サイクリングステップを使用するエレクトロポレーション法を開発し、ソマトスタチン発現阻害性インターニューロンを含む阻害ニューロンインターニューロンの遺伝子を初めてトランスフェクトすることを可能にした。しかしながら、異なる阻害性インターニューロン型および神経細胞発生段階におけるこのエレクトロポレーション法の信頼性は取り上げられていない。ここでは、このエレクトロポレーション技術が、興奮性ニューロンおよび異なるクラスのインターニューロンの両方に遺伝子をトランスフェクトできることを実証した。重要なことに、試験したインビトロ(DIV)スライス培養年齢に関係なく、トランスフェクション効率が高かった。この確立されたユーザーフレンドリーな技術は、インビトロマウス脳組織の文脈で異なる細胞タイプの単細胞エレクトロポレーションを使用することに興味のある研究者に強くお勧めします。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、励起性ニューロンと阻害性ニューロンの両方を高効率かつ高精度にトランスフェクトするエレクトロポレーション法について説明する。当社の最適化エレクトロポレーションプロトコルは、高効率遺伝子トランスフェクションを実現するための3つの革新的なブレークスルーを有しています。私たちの最初の変更は、以前に公開されたプロトコル3、5、6<sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、国立衛生補助金研究所(K.F.、T32 GM107000、F30MH122146からA.C.)によって支援されました。著者らは、渡辺直e氏に対し、技術面の技術支援に対し、感謝の気持ちを伝える。
Materials
| Plasmid preparation | |||
| Plasmid Purification Kit | Qiagen | 12362 | |
| Organotypic slice culture preparation | |||
| 6 Well Plates | GREINER BIO-ONE | 657160 | |
| Dumont #5/45 Forceps | FST | #5/45 | Angled dissection forceps for organotypic slice culture preparation |
| Flask Filter Unit | Millipore | SCHVU02RE | Filtration and storage of culture media |
| Incubator | Binder | BD C150-UL | |
| McIlwain Tissue Chopper | TED PELLA, INC. | 10180 | Tissue chopper for organotypic slice culture preparation |
| Millicell Cell Culture Insert, 30 mm | Millipore | PIHP03050 | Organotypic slice culture inserts |
| Osmometer | Precision Systems | OSMETTE II | |
| PTFE coated spatulas | Cole-Parmer | SK-06369-11 | |
| Scissors | FST | 14958-09 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Sterile Vacuum Filtration System | Millipore | SCGPT01RE | Filtration and storage of aCSF |
| Electrode preparation | |||
| Capillary Glasses | Warner Instruments | 640796 | |
| Micropipetter Puller | Sutter Instrument | P-1000 | Puller |
| Oven | Binder | BD (E2) | |
| Puller Filament | Sutter Instrument | FB330B | Puller |
| Single-cell electroporation and fluorescence imaging #1 | |||
| 3.5 mm Falcon Petri Dishes | BD Falcon | 353001 | |
| Airtable | TMC | 63-7512E | |
| CCD camera | Q Imaging | Retiga-2000DC | Camera |
| Electroporation System | Molecular Devices | Axoporator 800A | Electroporator |
| Fluorescence Illumination System | Prior | Lumen 200 | |
| Manipulator | Sutter Instrument | MPC-385 | Manipulator |
| Metamorph software | Molecular Devices | Image acquisition | |
| Peristaltic Pump | Rainin | Dynamax, RP-2 | Perfusion pump |
| Shifting Table | Luigs & Neuman | 240 XY | |
| Speaker | Unknown | Speakers connected to the electroporator | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ30 | |
| Table Top Incubator | Thermo Scientific | MIDI 40 | |
| Upright Microscope | Olympus | BX61WI | |
| Fluorescence imaging #2 | |||
| All-in-One Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X710 |
References
- Washbourne, P., McAllister, A. K. Techniques for gene transfer into neurons. Current Opinion in Neurobiology. 12 (5), 566-573 (2002).
- Capecchi, M. R. High efficiency transformation by direct microinjection of DNA into cultured mammalian cells. Cell. 22 (2), 479-488 (1980).
- Rae, J. L., Levis, R. A. Single-cell electroporation. Pflugers Archives: European Journal of Physiology. 443 (4), 664-670 (2002).
- Teruel, M. N., Blanpied, T. A., Shen, K., Augustine, G. J., Meyer, T. A versatile microporation technique for the transfection of cultured CNS neurons. Journal of Neuroscience Methods. 93 (1), 37-48 (1999).
- Rathenberg, J., Nevian, T., Witzemann, V. High-efficiency transfection of individual neurons using modified electrophysiology techniques. Journal of Neuroscience Methods. 126 (1), 91-98 (2003).
- Tanaka, M., Yanagawa, Y., Hirashima, N. Transfer of small interfering RNA by single-cell electroporation in cerebellar cell cultures. Journal of Neuroscience Methods. 178 (1), 80-86 (2009).
- Wiegert, J. S., Gee, C. E., Oertner, T. G. Single-Cell Electroporation of Neurons. Cold Spring Harbor Protocols. 2017 (2), 094904 (2017).
- Li, L., et al. A robot for high yield electrophysiology and morphology of single neurons in vivo. Nature Communication. 8, 15604 (2017).
- Steinmeyer, J. D., Yanik, M. F. High-throughput single-cell manipulation in brain tissue. PLoS One. 7 (4), 35603 (2012).
- Keener, D. G., Cheung, A., Futai, K. A highly efficient method for single-cell electroporation in mouse organotypic hippocampal slice culture. Journal of Neuroscience Methods. 337, 108632 (2020).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Ibata, K., Sun, Q., Turrigiano, G. G. Rapid synaptic scaling induced by changes in postsynaptic firing. Neuron. 57 (6), 819-826 (2008).
- Li, Y., et al. Electroporation on microchips: the harmful effects of pH changes and scaling down. Science Reports. 5, 17817 (2015).
- Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. Journal of Neuroscience. 30 (18), 6171-6177 (2010).
- Taverna, E., Haffner, C., Pepperkok, R., Huttner, W. B. A new approach to manipulate the fate of single neural stem cells in tissue. Nature Neurosciences. 15 (2), 329-337 (2011).
- Zhang, Y., Yu, L. C. Single-cell microinjection technology in cell biology. Bioessays. 30 (6), 606-610 (2008).
- De Simoni, A., Griesinger, C. B., Edwards, F. A. Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity. Journal of Physiology. 550, 135-147 (2003).
