Eletroporação unicelular em diferentes culturas organotipápicas de neurônios inibitórios hipocampais e inibidores específicos de classe
Summary
Apresentado aqui é um protocolo para eletroporação unicelular que pode fornecer genes em neurônios excitatórios e inibitórios em uma gama de idades in vitro de cultura de fatias hipocampais. Nossa abordagem fornece uma expressão precisa e eficiente de genes em células individuais, que podem ser usadas para examinar funções células autônomas e intercelulares.
Abstract
A eletroporação estabeleceu-se como um método crítico para transferir genes específicos para as células para entender sua função. Aqui, descrevemos uma técnica de eletroporação unicelular que maximiza a eficiência (~80%) da transfesão genética in vitro em neurônios inibitórios excitatórios e específicos de classe na cultura de fatia hipocampal organotipada do camundongo. Usando grandes eletrodos de vidro, fluido cerebrospinal artificial contendo tetrodotoxina e pulsos elétricos leves, entregamos um gene de interesse em neurônios piramimatais de CA1 hipocampal e interneurônios inibitórios. Além disso, a eletroporação poderia ser realizada em fatias hipocampais cultivadas até 21 dias in vitro sem redução na eficiência da transfecção, permitindo o estudo de diferentes estágios de desenvolvimento da cultura de fatias. Com o interesse crescente em examinar as funções moleculares dos genes em uma variedade diversificada de tipos celulares, nosso método demonstra uma abordagem confiável e direta para a transfecção genética in vitro no tecido cerebral do camundongo que pode ser realizada com equipamentos e técnicas de eletrofisiologia existentes.
Introduction
Na biologia molecular, uma das considerações mais importantes para um pesquisador é como entregar um gene de interesse em uma célula ou população de células para elucidar sua função. Os diferentes métodos de parto podem ser categorizados como biológicos (por exemplo, um vetor viral), químicos (por exemplo, fosfato de cálcio ou lipídico) ou físicos (por exemplo, eletroporação, microinjeção ou biolística)1,2. Os métodos biológicos são altamente eficientes e podem ser específicos do tipo celular, mas são limitados pelo desenvolvimento de ferramentas genéticas específicas. Abordagens químicas são muito poderosas in vitro, mas transfecções são geralmente aleatórias; além disso, essas abordagens são principalmente reservadas apenas para células primárias. Das abordagens físicas, a biolística é a mais simples e fácil do ponto de vista técnico, mas novamente produz resultados aleatórios de transfecção com uma eficiência relativamente baixa. Para aplicações que requerem transferência para células específicas sem a necessidade de desenvolver ferramentas genéticas, buscamos eletroporação unicelular3,4.
Considerando que a eletroporação usada para se referir apenas à eletroporação de campo, nos últimos vinte anos, vários protocolos de eletroporação unicelular in vitro e in vivo foram desenvolvidos para melhorar a especificidade e eficiência5,6,7, demonstrando que a eletroporação pode ser usada para transferir genes para células individuais e pode, portanto, ser extremamente precisa. No entanto, os procedimentos são tecnicamente exigentes, demorados e relativamente ineficientes. De fato, trabalhos mais recentes têm investigado a viabilidade das plataformas de eletroporação mecanizadas8,9, que podem ajudar a eliminar várias dessas barreiras para pesquisadores interessados em instalar tal robótica. Mas para aqueles que procuram meios mais simples, os problemas com eletroporação, ou seja, morte celular, falha de transfecção e entupimento de pipetas, permanecem uma preocupação.
Recentemente desenvolvemos um método de eletroporação que usa pipetas de vidro de ponta maior, parâmetros de pulso elétrico mais suaves e uma etapa de ciclismo de pressão única, que gerou uma eficiência de transfeção muito maior em neurônios excitatórios do que os métodos anteriores, e nos permitiu pela primeira vez transfectar genes em interneurônios inibitórios, incluindo interneurônios inibidores expressivos na região hipocampal ca1 da cultura organotipica do rato10. No entanto, a confiabilidade deste método de eletroporação em diferentes tipos inibitórios e estágios de desenvolvimento neuronal não foi abordada. Aqui, demonstramos que essa técnica de eletroporação é capaz de transfetar genes tanto em neurônios excitatórios quanto em diferentes classes de interneurônios. É importante ressaltar que a eficiência da transfecção foi alta independentemente dos dias in vitro (DIV) da idade da cultura da fatia testada. Esta técnica estabelecida e fácil de usar é altamente recomendada para qualquer investigador interessado em usar eletroporação unicelular para diferentes tipos de células no contexto do tecido cerebral in vitro do rato.
Protocol
Representative Results
Discussion
Descrevemos aqui um método de eletroporação que transfecta neurônios excitatórios e inibitórios com alta eficiência e precisão. Nosso protocolo de eletroporação otimizado tem três avanços inovadores para alcançar transfecção genética altamente eficiente. Nossa primeira modificação foi aumentar o tamanho da pipeta em comparação com os protocolos publicados anteriormente3,5,6. Essa mudança nos permitiu eletrop…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Subsídios à Saúde (R01NS085215 a K.F., T32 GM107000 e F30MH122146 a A.C.). Os autores agradecem à Sra. Naoe Watanabe por assistência técnica hábil.
Materials
| Plasmid preparation | |||
| Plasmid Purification Kit | Qiagen | 12362 | |
| Organotypic slice culture preparation | |||
| 6 Well Plates | GREINER BIO-ONE | 657160 | |
| Dumont #5/45 Forceps | FST | #5/45 | Angled dissection forceps for organotypic slice culture preparation |
| Flask Filter Unit | Millipore | SCHVU02RE | Filtration and storage of culture media |
| Incubator | Binder | BD C150-UL | |
| McIlwain Tissue Chopper | TED PELLA, INC. | 10180 | Tissue chopper for organotypic slice culture preparation |
| Millicell Cell Culture Insert, 30 mm | Millipore | PIHP03050 | Organotypic slice culture inserts |
| Osmometer | Precision Systems | OSMETTE II | |
| PTFE coated spatulas | Cole-Parmer | SK-06369-11 | |
| Scissors | FST | 14958-09 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Sterile Vacuum Filtration System | Millipore | SCGPT01RE | Filtration and storage of aCSF |
| Electrode preparation | |||
| Capillary Glasses | Warner Instruments | 640796 | |
| Micropipetter Puller | Sutter Instrument | P-1000 | Puller |
| Oven | Binder | BD (E2) | |
| Puller Filament | Sutter Instrument | FB330B | Puller |
| Single-cell electroporation and fluorescence imaging #1 | |||
| 3.5 mm Falcon Petri Dishes | BD Falcon | 353001 | |
| Airtable | TMC | 63-7512E | |
| CCD camera | Q Imaging | Retiga-2000DC | Camera |
| Electroporation System | Molecular Devices | Axoporator 800A | Electroporator |
| Fluorescence Illumination System | Prior | Lumen 200 | |
| Manipulator | Sutter Instrument | MPC-385 | Manipulator |
| Metamorph software | Molecular Devices | Image acquisition | |
| Peristaltic Pump | Rainin | Dynamax, RP-2 | Perfusion pump |
| Shifting Table | Luigs & Neuman | 240 XY | |
| Speaker | Unknown | Speakers connected to the electroporator | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ30 | |
| Table Top Incubator | Thermo Scientific | MIDI 40 | |
| Upright Microscope | Olympus | BX61WI | |
| Fluorescence imaging #2 | |||
| All-in-One Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X710 |
References
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