Encellig elektroporering över olika organotypiska slicekultur av mus hippocampal excitatorisk och klassspecifik hämmande nervceller
Summary
Presenteras här är ett protokoll för encellig elektroporering som kan leverera gener i både excitatoriska och hämmande nervceller över en rad in vitro hippocampal slice kultur åldrar. Vårt tillvägagångssätt ger ett exakt och effektivt uttryck för gener i enskilda celler, som kan användas för att undersöka cellautonoma och intercellulära funktioner.
Abstract
Elektroporering har etablerat sig som en kritisk metod för att överföra specifika gener till celler för att förstå deras funktion. Här beskriver vi en encellig elektroporationsteknik som maximerar effektiviteten (~ 80%) av in vitro gentransfektion i excitatoriska och klassspecifika hämmande nervceller i mus organotypiska hippocampal skiva kultur. Med hjälp av stora glaselektroder, tetrodotoxininnehållande konstgjord cerebrospinalvätska och milda elektriska pulser levererade vi en gen av intresse till odlade hippocampal CA1 pyramidala nervceller och hämmande interneuroner. Dessutom kunde elektroporation utföras i odlade hippocampal skivor upp till 21 dagar in vitro utan minskning av transfection effektivitet, vilket möjliggör studier av olika skiva kultur utvecklingsstadier. Med intresse för att undersöka geners molekylära funktioner över ett brett spektrum av celltyper visar vår metod en pålitlig och enkel inställning till in vitro-gentransfektion i mushjärnvävnad som kan utföras med befintlig elektrofysiologiutrustning och tekniker.
Introduction
Inom molekylärbiologi är en av de viktigaste övervägandena för en prövare hur man levererar en gen av intresse till en cell eller population av celler för att klargöra dess funktion. De olika leveransmetoderna kan kategoriseras som antingen biologiska (t.ex. en virusvektor), kemiska (t.ex. kalciumfosfat eller lipider) eller fysiska (t.ex. elektroporation, mikroinjektion eller biolistik)1,2. Biologiska metoder är mycket effektiva och kan vara celltypspecifika men begränsas av utvecklingen av specifika genetiska verktyg. Kemiska metoder är mycket kraftfulla in vitro, men transfektioner är i allmänhet slumpmässiga; Dessutom är dessa metoder mestadels reserverade endast för primära celler. Av de fysiska metoderna är biolistik den enklaste och enklaste ur teknisk synvinkel, men producerar återigen slumpmässiga transfection-resultat med relativt låg effektivitet. För applikationer som kräver överföring till specifika celler utan behov av att utveckla genetiska verktyg tittar vi mot encellselektroporation3,4.
Medan elektroporering som används för att endast hänvisa till fältelektroporation, under de senaste tjugo åren, flera in vitro- och in vivo encelliga elektroporeringsprotokoll har utvecklats för att förbättra specificitet ocheffektivitet 5,6,7, vilket visar att elektroporering kan användas för att överföra gener till enskilda celler och kan därför vara extremt exakt. Förfarandena är dock tekniskt krävande, tidskrävande och relativt ineffektiva. Faktum är att nyare artiklar har undersökt genomförbarheten av mekaniserade elektroporationsriggar8,9, vilket kan bidra till att eliminera flera av dessa hinder för utredare som är intresserade av att installera sådan robotteknik. Men för dem som letar efter enklare medel förblir problemen med elektroporering, nämligen celldöd, transfection misslyckande och pipett igensättning, fortfarande ett problem.
Vi utvecklade nyligen en elektroporeringsmetod som använder större tippade glaspipetter, mildare elektriska pulsparametrar och ett unikt tryckcyklingssteg, som genererade en mycket högre transfektionseffektivitet i excitatoriska neuroner än tidigare metoder, och gjorde det möjligt för oss för första gången att transfektera gener i hämmande interneuroner, inklusive somatostatin-uttryckande hämmande interneuroner i hippocampal CA1-regionen av musorganotypisk skivakultur 10. Tillförlitligheten hos denna elektroporation metod i olika hämmande interneuron typer och neuronal utvecklingsmässiga stadier har dock inte åtgärdats. Här visade vi att denna elektroporationsteknik kan överföra gener till både excitatoriska nervceller och olika klasser av interneuroner. Viktigt, transfection effektivitet var hög oavsett dagar in vitro (DIV) skiva kultur ålder testas. Denna etablerade och användarvänliga teknik rekommenderas starkt till alla prövare som är intresserade av att använda encellig elektroporering för olika celltyper i samband med in vitro-mushjärnvävnad.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi beskriver här en elektroporeringsmetod som transfektar både excitatoriska och hämmande nervceller med hög effektivitet och precision. Vårt optimerade elektroporationsprotokoll har tre innovativa genombrott för att uppnå högeffektiv gentransfection. Vår första ändring var att öka pipettstorleken jämfört med tidigare publicerade protokoll3,5,6. Denna förändring gjorde det möjligt för oss att elektroporera mån…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health Grants (R01NS085215 till K.F., T32 GM107000 och F30MH122146 till A.C.). Författarna tackar Ms. Naoe Watanabe för skicklig teknisk hjälp.
Materials
| Plasmid preparation | |||
| Plasmid Purification Kit | Qiagen | 12362 | |
| Organotypic slice culture preparation | |||
| 6 Well Plates | GREINER BIO-ONE | 657160 | |
| Dumont #5/45 Forceps | FST | #5/45 | Angled dissection forceps for organotypic slice culture preparation |
| Flask Filter Unit | Millipore | SCHVU02RE | Filtration and storage of culture media |
| Incubator | Binder | BD C150-UL | |
| McIlwain Tissue Chopper | TED PELLA, INC. | 10180 | Tissue chopper for organotypic slice culture preparation |
| Millicell Cell Culture Insert, 30 mm | Millipore | PIHP03050 | Organotypic slice culture inserts |
| Osmometer | Precision Systems | OSMETTE II | |
| PTFE coated spatulas | Cole-Parmer | SK-06369-11 | |
| Scissors | FST | 14958-09 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Sterile Vacuum Filtration System | Millipore | SCGPT01RE | Filtration and storage of aCSF |
| Electrode preparation | |||
| Capillary Glasses | Warner Instruments | 640796 | |
| Micropipetter Puller | Sutter Instrument | P-1000 | Puller |
| Oven | Binder | BD (E2) | |
| Puller Filament | Sutter Instrument | FB330B | Puller |
| Single-cell electroporation and fluorescence imaging #1 | |||
| 3.5 mm Falcon Petri Dishes | BD Falcon | 353001 | |
| Airtable | TMC | 63-7512E | |
| CCD camera | Q Imaging | Retiga-2000DC | Camera |
| Electroporation System | Molecular Devices | Axoporator 800A | Electroporator |
| Fluorescence Illumination System | Prior | Lumen 200 | |
| Manipulator | Sutter Instrument | MPC-385 | Manipulator |
| Metamorph software | Molecular Devices | Image acquisition | |
| Peristaltic Pump | Rainin | Dynamax, RP-2 | Perfusion pump |
| Shifting Table | Luigs & Neuman | 240 XY | |
| Speaker | Unknown | Speakers connected to the electroporator | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ30 | |
| Table Top Incubator | Thermo Scientific | MIDI 40 | |
| Upright Microscope | Olympus | BX61WI | |
| Fluorescence imaging #2 | |||
| All-in-One Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X710 |
References
- Washbourne, P., McAllister, A. K. Techniques for gene transfer into neurons. Current Opinion in Neurobiology. 12 (5), 566-573 (2002).
- Capecchi, M. R. High efficiency transformation by direct microinjection of DNA into cultured mammalian cells. Cell. 22 (2), 479-488 (1980).
- Rae, J. L., Levis, R. A. Single-cell electroporation. Pflugers Archives: European Journal of Physiology. 443 (4), 664-670 (2002).
- Teruel, M. N., Blanpied, T. A., Shen, K., Augustine, G. J., Meyer, T. A versatile microporation technique for the transfection of cultured CNS neurons. Journal of Neuroscience Methods. 93 (1), 37-48 (1999).
- Rathenberg, J., Nevian, T., Witzemann, V. High-efficiency transfection of individual neurons using modified electrophysiology techniques. Journal of Neuroscience Methods. 126 (1), 91-98 (2003).
- Tanaka, M., Yanagawa, Y., Hirashima, N. Transfer of small interfering RNA by single-cell electroporation in cerebellar cell cultures. Journal of Neuroscience Methods. 178 (1), 80-86 (2009).
- Wiegert, J. S., Gee, C. E., Oertner, T. G. Single-Cell Electroporation of Neurons. Cold Spring Harbor Protocols. 2017 (2), 094904 (2017).
- Li, L., et al. A robot for high yield electrophysiology and morphology of single neurons in vivo. Nature Communication. 8, 15604 (2017).
- Steinmeyer, J. D., Yanik, M. F. High-throughput single-cell manipulation in brain tissue. PLoS One. 7 (4), 35603 (2012).
- Keener, D. G., Cheung, A., Futai, K. A highly efficient method for single-cell electroporation in mouse organotypic hippocampal slice culture. Journal of Neuroscience Methods. 337, 108632 (2020).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Ibata, K., Sun, Q., Turrigiano, G. G. Rapid synaptic scaling induced by changes in postsynaptic firing. Neuron. 57 (6), 819-826 (2008).
- Li, Y., et al. Electroporation on microchips: the harmful effects of pH changes and scaling down. Science Reports. 5, 17817 (2015).
- Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. Journal of Neuroscience. 30 (18), 6171-6177 (2010).
- Taverna, E., Haffner, C., Pepperkok, R., Huttner, W. B. A new approach to manipulate the fate of single neural stem cells in tissue. Nature Neurosciences. 15 (2), 329-337 (2011).
- Zhang, Y., Yu, L. C. Single-cell microinjection technology in cell biology. Bioessays. 30 (6), 606-610 (2008).
- De Simoni, A., Griesinger, C. B., Edwards, F. A. Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity. Journal of Physiology. 550, 135-147 (2003).
