여기서 우리는 성인 마우스 고환에서 살아있는 메이오틱 및 후 메이오성 세균 세포를 격리하는 간단하고 효율적인 방법을 제시합니다. 낮은 세포 독성, 보라색 흥분 DNA 결합 염료 및 형광 활성화 세포 분류를 사용 하 여, 하나는 많은 다운 스트림 응용 프로그램에 대 한 고도로 농축 된 정자 세포 인구를 격리할 수 있습니다.
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방법 논문
보라색 흥분 세포 투과성 DNA 결합 염료를 사용하여 뮤린 정자 세포의 격리
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
메이오성 정자 세포의 격리는 meiosis 및 정자 발생의 근본적인 분자 기계장치를 조사하기 위하여 필수적입니다. Hoechst 33342를 사용하여 세포 격리 프로토콜이 확립되어 있지만 형광 활성화 셀 선별과 함께 염색되지만 자외선 레이저가 장착 된 세포 선별기가 필요합니다. 여기서 우리는 염료 자전거 바이올렛 (DCV) 얼룩을 사용하여 세포 격리 프로토콜을 설명, 낮은 세포 독성 DNA 결합 염료는 구조적으로 Hoechst 33342와 유사. DCV는 자외선과 보라색 레이저 모두에 의해 흥분 될 수 있으며, 자외선 레이저가 장착되지 않은 셀 선별기를 포함하여 장비 선택의 유연성을 향상시킵니다. 이 프로토콜을 사용하여, 하나는 렙토텐 / zygotene, pachytene 및 디플롯렌 정자 세포뿐만 아니라, 메이오틱 한 후 정자를 포함하여 메이오틱 프PHASE I에서 3 개의 라이브 셀 하위 집단을 격리 할 수 있습니다. 우리는 또한 마우스 고환에서 단세포 현탁액을 준비하는 프로토콜을 설명합니다. 전반적으로 이 절차는 완료하는 데 짧은 시간(필요한 셀 수에 따라 4-5시간)이 필요하며, 이는 많은 다운스트림 응용 프로그램을 용이하게 합니다.
서론
정자 발생은 정자 줄기 세포의 작은 인구가 성인 생활1,2에걸쳐 많은 수의 정자의 지속적인 생산을 유지하는 복잡한 과정이다. 정자 발생 동안, 동적 크로마틴 리모델링은 정자 세포가 혈전증을 유발하여3, 4,5를생성할 때 일어난다. 메이오혈 정자 세포의 분리는 분자 조사에 필수적이며, 퇴적물 계분리6,7 및 형광 활성화 세포 분류 (FACS)8,9,10,11,12,13,14, 14,
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프로토콜
이 프로토콜은 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 지침을 따릅니다 (프로토콜 번호. IACUC2018-0040) 신시내티 아동 병원 의료 센터에서.
1. 고환 세포 현탁액의 준비를위한 장비 및 시약 설정
- 각 효소 육수를 1x 행크스의 균형 잡힌 소금 용액(HBSS)으로준비하고 -20°C(표1)에 보관하십시오.
참고: 실험 전에 언제든지 준비합니다. - 실험 하루 전: 하룻밤 4°C에서 태아 소 혈청(FBS)을 가진 튜브 수집 튜브(1.5mL 튜브).
- 실험 당일: 수조를 37°C로 설정합니다.
- 37°C에서 미리 따뜻한 덜벡코의 수정된 이글 배지(DMEM)는 15mL 원심분리기 튜브에서 사용하기직전 각 시료에 대해 2mL의 1x 해리 버퍼를 준비한다.
참고: 2mL 해리 버퍼는 두 개의 고환에 대해 준비됩니다. 해리 버퍼 레시피의 경우 표 1을참조하십시오.
2. 고환 세포 현탁액의 동물 해부 및 준비
- 8주된 수컷 마우스를 최소 10분 동안 이산화탄소 실에 남겨두어 희생하십시오.
- 얼음-차....
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결과
이 정렬 프로토콜의 대표적인 결과는 그림 3에표시됩니다. 두 고환 (1 마우스)의 총 정렬 시간은 일반적으로 약 3 시간, 셀 서스펜션의 농도 및 선별 속도에 따라 달라집니다. 선별 후, 정자 세포의 순도는 SYCP3 및 γH2AX(도 3A)의면역 염색에 의해 확인된다. 정렬된 L/Z, P, D 정자세포 분획의 대표적인 순도는 각각 약 80.4%, 90.6%, 87.6%이다(그림3C). 이전에19이전에게시한 기준에 따라 하위 스테이지를 결정했습니다. 간략하게, 렙토텐과 zygotene 단계에서, 동종 염색체 사이의 시냅스는 불완전하며, 이는 SYCP3 염색의 얇은 실로 표시됩니다. 광범위한 γH2AX 도메인은 프로그래밍된 DNA 이중 가닥 휴식으로 인해 핵 크로마틴 전체에 걸쳐 관찰된다. 파시텐 단계에서, 동종 염색체는 완전히 .......
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토론
여기에서 우리는 단일 성인 남성 마우스에서 정자 세포와 정자의 하위 인구를 격리하기 위하여 실용적이고 간단한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜의 재현성을 보장하기 위해 주의가 필요한 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 효소 소화 전에, 세척 단계는 간질 세포를 제거하는 것을 목표로; 소화 후,이 단계는 정자와 파편을 제거하는 데 도움이됩니다. 세탁/원심 분리는 3배나 중요합니다. 우리의 해리 완충 레시피에서, 몇몇 다른 효소의 조합은 과도한 세포 손상 없이 단세포 현탁액으로 고환의 해리를 용이하게 합니다. 기포를 일으키지 않도록 부드럽게 파이펫팅하면 세포 무결성을 보호하는 데도 도움이 됩니다. 절개 후 현미경으로 세포 현탁액을 확인하여 현탁액이 단일 세포 수준을 달성했는지 확인하십시오. 과도한 소화로 인한 불완전한 해리 또는 이물질 오염은 정렬된 세포의 순도에 영향을 미칩니다. 그림 S2에표시된 바와 같이, 직립 인구는 정자의 파편과 테트라머를 포함합니다. DCV 염색은 어둠 속에서 인큐베이션이 필.......
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공개 사항
저자는 그들이 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.
감사의 글
네카와, 요시다, 마에자와 연구소 회원들에게 도움을 주신 것에 감사드립니다. 원고편집을 위한 케이티 게르하르트; H1T 항체를 공유하기위한 메리 앤 헨델, 신시내티 아동 병원 의료 센터 (CCHMC) NIH S10OD023410에 의해 지원 되는 FACS 장비를 공유 하기 위한 연구 흐름 사이토 메 트리 코어; 과학 연구를 위한 보조금 지원 (KAKENHI; 17K07424) T.N.에; Lalor 재단 박사 후 A.S.에 대한 펠로우십; AMED-CREST (JP17gm110005h00001) - S.Y.; 아자부대학 연구서비스부, 교육부, 문화체육과학기술부(MEXT) 지원 프로그램 (2016~2019), 연구활동 스타트업 보조금 지원(19K21196), 다케다과학재단(2019), 우에하라재단(2019년.M) 건강의 국립 연구소 R01 GM122776 에 S.H.N.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1.5 ml 튜브 | Watson | 131-7155C | |
| 100 mm 페트리 디쉬 | Corning, Falcon | 351029 | |
| 15 mL 원심분리기 튜브 | Watson | 1332-015S | |
| 5 ml 폴리스티렌 튜브 셀 스트레이너 스냅 캡 (35 µ m 나일론 메쉬) | Corning, Falcon | 352235 | |
| 50 mL 원심 분리기 튜브 | Watson | 1342-050S | |
| 60 mm 페트리 접시 | Corning, Falcon | 351007 | |
| 70 µ m 나일론 메쉬 | Corning, Falcon | 352350 | |
| 세포 분류기 | Sony | SH800S | |
| 원심 분리기 | |||
| 콜라겐 분해 효소, 재조합, 동물 유래 무료 | 후지 필름 Wako Pure Chemical Corporation | 036-23141 | |
| 콜라겐 분해 효소, 유형 1 | Worthington | LS004196 | |
| 커버 유리 | Fisher | 12-544-G | |
| Cytospin 3 | Shandon | ||
| DAPI (4', 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Fisher | D1306 | 작업 농도 : 0.1 μ g/mL |
| Dnase I | 시그마 | D5025-150KU | |
| 당나귀 세럼 | 시그마 | S30-M | |
| Dulbecco' s 인산염 완충 식염수(DPBS) | Gibco | 14190144 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM) | Gibco | 11885076 | |
| 소 태아 혈청(FBS) | Gibco | 16000044 | |
| Ann Handel | 1/2000 희석 | Histone H1t 항체 | |
| s 평형염 용액(HBSS) | Gibco | 14175095 | |
| 소 고환에서 추출한 히알루로니다아제 | Sigma | H3506-1G | |
| 인산염 완충 식염수(PBS) | Sigma | P5493-4L | |
| Pipettemen | |||
| ProLong Gold Antifade | Mountant Fisher | P36930 | |
| rH2AX 항체 | Millipore | 05-635 | 작업 집중도: 2 μ g/mL |
| 정자 수정 단백질 56 (Sp56) 항체 | QED Bioscience | 55101 | 작동 농도: 0.5 μ g / mL |
| 멸균 겸자 및 가위 | |||
| Superfrost / Plus 현미경 슬라이드 | Fisher | 12-550-15 | |
| SYCP3 항체 | Abcam | ab205846 | 작동 농도 : 5 μ g/mL |
| TWEEN 20 (폴리소르베이트 20) | Sigma | P9416 | |
| Vybrant DyeCycle 바이올렛 스테인(DCV) | Invitrogen | V35003 | |
| 수조 |
참고문헌
- Griswold, M. D. Spermatogenesis: The Commitment to Meiosis. Physiological Reviews. 96 (1), 1-17 (2016).
- Yoshida, S. Mouse Spermatogenesis Reflects the Unity and Diversity of Tissue Stem Cell Niche Systems. Cold Spring Harbor Perspectives ....
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