Kvæg ovarie cortex vævskultur

Summary

In vitro kultur af kvæg ovarie cortex og effekten af ernæringsmæssige trappe-trin kost på æggestokkene mikromiljø præsenteres. Ovarie cortex stykker blev kultiveret i syv dage og steroider, cytokiner, og follikel faser blev evalueret. Den Stair-Step kost behandling havde øget steroidogenese resulterer i follikel progression i kultur.

Abstract

Follikel udvikling fra ur til antral fase er en dynamisk proces inden for æggestokkene cortex, som omfatter endokrine og parakrine faktorer fra somatiske celler og cumulus celle-oocyt kommunikation. Lidt er kendt om æggestokkene mikromiljø og hvordan kytokiner og steroider produceret i det omgivende miljø påvirke follikel progression eller anholdelse. In vitro kultur æggestokkene cortex gør det muligt follikler til at udvikle sig i et normaliseret miljø, der forbliver understøttet af tilstødende stroma. Vores mål var at bestemme effekten af ernæringsmæssige Stair-Step kost på æggestokkene mikromiljø (follikel udvikling, steroid, og cytokin produktion) gennem in vitro kultur af kvæg ovarie cortex. For at opnå dette blev æggestokkene kortikale stykker fjernet fra kvier, der gennemgår to forskellige ernæringsmæssigt udviklede ordninger før puberteten: Kontrol (traditionel ernæringsudvikling) og Stair-Step (fodring og begrænsning under udvikling), der blev skåret i ca. 0,5-1 mm³ stykker. Disse stykker blev efterfølgende passeret gennem en række vasker og placeret på en vævskulturindsats, der er sat i et godt indeholdende Waymouths kulturmedium. Ovarie cortex blev kultiveret i 7 dage med daglige kulturmedier ændringer. Histologisk sektion blev udført for at bestemme follikel fase ændringer før og efter kulturen til at bestemme virkningerne af ernæring og virkningen af kultur uden yderligere behandling. Cortex kultur medium blev samlet over dage til at måle steroider, steroid metabolitter, og cytokiner. Der var tendenser til øget steroid hormoner i æggestokkene mikromiljø, der tillod follikel progression i Stair-Step versus Control æggestokkene cortex kulturer. Den ovarie cortex kultur teknik giver mulighed for en bedre forståelse af æggestokkene mikromiljø, og hvordan ændringer i endokrine sekretion kan påvirke follikel progression og vækst fra både in vivo og in vitro behandlinger. Denne kultur metode kan også vise sig gavnligt for at teste potentielle terapeutiske, der kan forbedre follikel progression hos kvinder til at fremme fertiliteten.

Introduction

Æggestokken cortex repræsenterer det ydre lag af æggestokken, hvor follikel udvikling forekommer¹. Ursække, der oprindeligt blev arresteret under udvikling, vil blive aktiveret til at blive primære, sekundære og derefter antrale eller tertiære follikler baseret på parakrine og gonadotropinin input^1,2,3,4. For bedre at forstå fysiologiske processer i æggestokken kan vævskultur bruges som en in vitro-model, hvilket giver mulighed for et kontrolleret miljø til at udføre eksperimenter. Mange undersøgelser har udnyttet æggestokkene væv kultur for forskning i assisteret reproduktiv teknologi, fertilitet bevarelse, og kræft i æggestokkene^5,6,7. Ovarievævskultur har også fungeret som model for undersøgelse af reproduktive toksiner, der skader æggestokkenes sundhed og ætiologien af reproduktive lidelser som polycystisk ovarie syndrom (PCOS)^8,9,10,11. Således gælder dette kultursystem for en bred vifte af specialiteter.

Hos gnavere er hele foster- eller perinatale gonader blevet anvendt i reproduktive biologiforsøg^12,13,14,15. Gonader fra større husdyr kan imidlertid ikke dyrkes som hele organer på grund af deres store størrelse og potentielle degeneration. Derfor skæres kvæg og ikke-human primat ovarie cortex i mindre stykker^16,17,18. Mange undersøgelser har kultiveret små ovarie cortex stykker til at studere forskellige vækstfaktor (r) i ursækken indledning i husdyr og ikke-menneskelige primater^1,17,18,19. Brugen af ovarie cortexkultur har også vist primordial follikelinitiering i mangel af serum til kvæg og primat kortikale stykker, der er kultiveret i 7 dage²⁰. Yang og Fortune i 2006 behandlet føtal ovarie cortex kultur medium med en række testosteron doser over 10 dage og bemærkede, at 10^-7 M koncentrationen af testosteron øget follikel rekruttering, overlevelse, og øget progression af tidlige fase follikler¹⁹. I 2007, ved hjælp af æggestokkene cortex kulturer fra kvæg fostre (5-8 måneders svangerskab), Yang og Fortune rapporterede en rolle for Vaskulære Endothelial Growth Factor A (VEGFA) i den primære til sekundære follikel overgang²¹. Desuden har vores laboratorium udnyttet æggestokkene cortex kulturer til at demonstrere, hvordan VEGFA isoforme (angiogen, antiangiogen, og en kombination) kan regulere forskellige signal transduktion veje gennem Kinase domæne receptor (KDR), som er den vigtigste signal transduktion receptor, VEGFA binder¹⁶. Disse oplysninger gav mulighed for en bedre forståelse af, hvordan forskellige VEGFA-isoformer påvirker signalvejene til at fremkalde follikel progression eller anholdelse. Samlet set, dyrkning af æggestokkene cortex stykker in vitro med forskellige steroider eller vækstfaktorer kan være en værdifuld analyse til at bestemme virkningerne på mekanismer, der regulerer folliculogenese. På samme måde kan dyr, der er udviklet på forskellige ernæringsmæssige regimer, have ændret ovariemikrvironments, som kan fremme eller hæmme folliculogenese, der påvirker kvinders reproduktive modenhed. Således er vores mål i det nuværende manuskript at rapportere kvæg cortex kultur teknik og afgøre, om der er forskelle i æggestokkene mikromiljø efter in vitro kultur af kvæg cortex fra kvier fodret enten Control eller Stair-Step kost indsamlet på 13 måneder som beskrevet tidligere¹⁶.

Derfor var vores næste skridt at bestemme det æggestokkene mikromiljø i disse kvier, der blev udviklet med forskellige ernæringsmæssige kostvaner. Vi evaluerede æggestokkene cortex fra kvier fodret med enten en Stair-Step eller Control kost. Kontrol kvier blev tilbudt en vedligeholdelse kost på 97,9 g / kg^0,75 i 84 dage. Stair-Step-diæten blev indledt efter 8 måneder, der indeholdt en begrænset fodret kost på 67,4 g / kg^0,75 i 84 dage. Efter de første 84 dage, mens Control kvier fortsatte med at modtage 97,9 g / kg^0,75, blev Stair-Step oksekød kvier tilbudt 118,9 g / kg^0,75 i yderligere 68 dage, hvorefter de blev ovariektomi ved 13 måneder¹⁶ for at studere ændringer i follikulære stadier og morfologi før og efter kultur. Vi har også analyseret for forskelle i steroider, steroid metabolitter, chemokines, og cytokiner udskilles i cortex medier. Steroider og andre metabolitter blev målt for at afgøre, om der var nogen direkte virkninger fra behandlinger udført in vivo og/eller in vitro på væv levedygtighed og produktivitet. Ændringer i æggestokkene mikromiljø før og efter kultur gav et øjebliksbillede af det endokrine miljø og folliculogenese forud for kultur, og hvordan kultur eller behandling under kultur påvirker follikel progression eller anholdelse.

Æggestokke blev indsamlet efter ovariektomi blev udført på US Meat Animal Research Center (USMARC) i henhold til deres IACUC procedurer fra Control and Stair-Step kvier på 13 måneder af^{alder 16}, rengøres med steril fosfat buffer saltvand (PBS) vasker med 0,1% antibiotika til at fjerne blod og andre forurenende stoffer, trimmet overskydende væv, og transporteres til University of Nebraska-Lincoln (UNL) Reproduktiv fysiologi laboratorium UNL på 37 ° C²³ . Ved UNL blev ovarie cortexstykker skåret i små firkantede stykker (~ 0,5-1 mm^3; Figur 1) og dyrkes i 7 dage (figur 2). Histologi blev udført på cortex kultur dias før og efter kultur til at bestemme follikler fase^16,24 (Figur 3 og Figur 4), og ekstracellulære matrix proteiner, der kan indikere fibrose (Picro-Sirus Red, PSR; Figur 5. Dette gjorde det muligt at fastslå virkningen af in vivo ernæringsmæssige regimer på follikel stadier og tilladt sammenligning af 7 dages ovarie cortex på follikel stadier og follikel progression. Gennem hele kulturen blev mediet indsamlet og ændret dagligt (ca. 70% af medierne blev indsamlet hver dag; 250 μL/brønd), således at enten daglige hormoner/cytokiner/chemokiner kan vurderes eller samles over dage for at opnå gennemsnitlige koncentrationer. Steroider såsom androstenedion (A4) og østrogen (E2) kan samles over 3 dage og vurderes gennem radioimmunoassay (RIA; Figur 6) og samlet over 4 dage pr. dyr og analyseret via højtydende flydende kromatografi-massespektrometri (HPLC-MS)^24,25 ( tabel1). Cytokin arrays blev udnyttet til at vurdere cytokin og chemokin koncentrationer i æggestokkene cortex kultur medium²⁶ (tabel 2). Realtid polymerase kædereaktion (RT-PCR) assay plader blev udført for at bestemme genekspression for specifikke signal transduktion veje som påvist tidligere¹⁶. Alle steroid, cytokin, follikel fase og histologiske markører giver et øjebliksbillede af æggestokkene mikromiljø og spor om evnen til at mikromiljøet til at fremme “normal” eller “unormal” folliculogenese.

Protocol

Æggestokkene blev fremstillet fra U. S. Meat Animal Research Center16. Som tidligere nævnt16, alle procedurer blev godkendt af U.S. Meat Animal Research Center (USMARC) Animal Care and Use Committee i overensstemmelse med vejledningen for pleje og brug af landbrugsdyr i landbrugsforskning og undervisning. Æggestokkene blev bragt til University of Nebraska-Lincoln Reproduktiv Laboratory, hvor de blev behandlet og kultiveret. 1. Forberedelse af p?…

Representative Results

Denne kvæg cortex kultur procedure kan bruges til at bestemme en bred vifte af hormon, cytokin, og histologi data fra små stykker af æggestokken. Farvning, såsom hæmatoxylin og eosin (H&E), kan bruges til at bestemme ovariemorfologi gennem follikel iscenesættelse16,23,31 ( Figur3). Kort sagt blev follikler klassificeret som ur, som er en oocyt omgivet af et enkelt lag af pladeagtige præ-granu…

Discussion

Fordelen ved in vitro ovarie cortex kultur, som beskrevet i dette manuskript, er, at folliklerne udvikler sig i et normaliseret miljø med tilstødende stroma omkring folliklerne. De somatiske celler og oocyt forbliver intakte, og der er passende celle-til-celle kommunikation som en in vivo-model. Vores laboratorium har konstateret, at en 7-dages kultur system giver repræsentative folliculogenese og steroidogenese data til behandling af æggestokkene cortex. Andre protokoller for ovarievævskultur har enten relativt kor…

Materials

#11 Scapel Blade	Swann-Morton	303	Scaple Blade
#21 Scapel Blade	Swann-Morton	307	Scaple Blade
500mL Bottle Top Filter	Corning	430514	Bottle Top Filter 0.22 µm pore for filtering medium
AbsoluteIDQ Sterol17 Assay	Biocrates	Sterol17 Kit	Samples are sent off to Biocrates and steroid panels are run and results are returned
Androstenedione Double Antibody RIA Kit	MPBio	7109202	RIA to determine androstenedione from culture medium
Belgium A4 Assay Kit	DIA Source	KIP0451	RIA to determine androstenedione from culture medium
Bovine Cytokine Array Q3	RayBiotech	QAB-CYT-3-1	Cytokine kit to determine cytokines from culture medium
cellSens Software Standard 1.3	Olympus	7790	Imaging Software
Insulin-Transferrin-Selenium-X	Gibco ThermoFisher Scientific	5150056	Addative to the culture medium
Leibovitz's L-15 Medium	Gibco ThermoFisher Scientific	4130039	Used for tissue washing on clean bench, and in the biosafety cabniet
Microscope	Olympus	SZX16	Disection microscope used for imaging tissue culture pieces
Microscope Camera	Olympus	DP71	Microscope cameraused for imaging tissue culture pieces
Millicell Cell Culture Inserts 0.4µm, 12,mm Diameter	Millipore Sigma	PICM01250	Inserts that allow the tissue to rest against the medium without being submerged in it
Multiwell 24 well plate	Falcon	353047	Plate used to hold meduim, inserts, and tissues
Petri dish 60 x 15 mm	Falcon	351007	Petri dish used for washing steps prior to culture
Phosphate-Buffered Saline (PBS 1X)	Corning	21-040-CV	Used for tissue washing
SAS Version 9.3	SAS Institute	9.3 TS1M2	Statistical analysis software
Thomas Stadie-Riggs Tissue Slicer	Thomas Scientific	6727C10	Tissue slicer for preperation of thin uniform sections of fresh tissue
Waymouth MB 752/1 Medium	Sigma-Aldrich	W1625	Medium used for tissue cultures