JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
생물학

Bovine Ovarian Cortex Weefselkweek

Published: January 14, 2021
doi:
10.3791/61668
, , ,
1Department of Animal Science,University of Nebraska-Lincoln, 2Department of Animal Production, School of Agriculture,University of Jordan

Summary

In vitro cultuur van runder ovarium cortex en het effect van nutritionele trap-stap dieet op ovariële micro-omgeving wordt gepresenteerd. Ovariële cortexstukken werden gedurende zeven dagen gekweekt en steroïden, cytokines en follikelstadia werden geëvalueerd. De Stair-Step dieetbehandeling had een verhoogde steroidogenese, wat resulteerde in follikelprogressie in cultuur.

Abstract

Follikelontwikkeling van het primordiale tot antrale stadium is een dynamisch proces in de ovariële cortex, dat endocriene en paracriene factoren van somatische cellen en cumulus cel-oöcytcommunicatie omvat. Er is weinig bekend over de ovariële micro-omgeving en hoe de cytokines en steroïden die in het omringende milieu worden geproduceerd, de follikelprogressie of -arrestatie beïnvloeden. In vitro cultuur van de ovariële cortex maakt het mogelijk om follikels te ontwikkelen in een genormaliseerde omgeving die ondersteund blijft door aangrenzend stroma. Ons doel was om het effect van het nutritionele Stair-Step dieet op de ovariële micro-omgeving (follikelontwikkeling, steroïde en cytokineproductie) te bepalen door middel van in vitro cultuur van de boviene ovariumschors. Om dit te bereiken, werden ovariële corticale stukjes verwijderd van vaarzen die voorafgaand aan de puberteit twee verschillende nutritioneel ontwikkelde schema’s ondergingen: Control (traditionele voedingsontwikkeling) en Stair-Step (voeding en beperking tijdens de ontwikkeling) die in ongeveer 0,5-1 mm3-stukken werden gesneden. Deze stukken werden vervolgens door een reeks wasbeurten geleid en op een weefselkweekinzet geplaatst die in een put met het kweekmedium van Waymouth wordt geplaatst. De ovariële cortex werd gedurende 7 dagen gekweekt met dagelijkse veranderingen in de cultuurmedia. Histologische sectie werd uitgevoerd om follikelstadiumveranderingen voor en na de kweek te bepalen om de effecten van voeding en de impact van cultuur te bepalen zonder aanvullende behandeling. Cortex cultuur medium werd gepoold over dagen om steroïden, steroïde metabolieten en cytokines te meten. Er waren tendensen voor verhoogde steroïde hormonen in de ovariële micro-omgeving die follikelprogressie mogelijk maakten in de Stair-Step versus Control ovariële cortexculturen. De ovariële cortexcultuurtechniek zorgt voor een beter begrip van de ovariële micro-omgeving en hoe veranderingen in endocriene secretie de follikelprogressie en -groei van zowel in vivo als in vitro behandelingen kunnen beïnvloeden. Deze kweekmethode kan ook gunstig zijn voor het testen van potentiële therapieën die de follikelprogressie bij vrouwen kunnen verbeteren om de vruchtbaarheid te bevorderen.

Introduction

De ovariële cortex vertegenwoordigt de buitenste laag van de eierstok waar follikelontwikkeling optreedt1. Primordiale follikels, aanvankelijk gestopt in ontwikkeling, zullen worden geactiveerd om primaire, secundaire en vervolgens antrale of tertiaire follikels te worden op basis van paracriene en gonadotrofine-ingangen1,2,3,4. Om fysiologische processen in de eierstok beter te begrijpen, kan weefselkweek worden gebruikt als een in vitro model, waardoor een gecontroleerde omgeving mogelijk is om experimenten uit te voeren. Veel studies hebben gebruik gemaakt van eierstokweefselkweek voor onderzoek naar geassisteerde voortplantingstechnologie, vruchtbaarheidsbehoud en eierstokkanker5,6,7. Ovariële weefselkweek heeft ook gediend als een model voor het onderzoeken van reproductieve toxines die de gezondheid van de eierstokken en de etiologie van reproductieve aandoeningen zoals polycysteus ovariumsyndroom (PCOS)8,9,10,11schaden. Dit cultuursysteem is dus toepasbaar op een breed scala aan specialiteiten.

Bij knaagdieren zijn hele foetale of perinatale geslachtsklieren gebruikt in experimenten met reproductieve biologie12,13,14,15. Gonaden van grotere huisdieren kunnen echter niet als hele organen worden gekweekt vanwege hun grote omvang en potentiële degeneratie. Daarom wordt de ovariële cortex van runderen en niet-menselijke primaten in kleinere stukken gesneden16,17,18. Veel studies hebben kleine ovariële cortexstukken gekweekt om verschillende groeifactor (en) te bestuderen in primordiale follikelinitiatie bij gedomesticeerd vee en niet-menselijke primaten1,17,18,19. Het gebruik van ovariële cortexcultuur heeft ook primordiale follikelinitiatie aangetoond in afwezigheid van serum voor corticale stukjes van runderen en primaten gekweekt gedurende 7 dagen20. Yang en Fortune behandelden in 2006 foetale ovariële cortexcultuurmedium met een reeks testosterondoses gedurende 10 dagen en merkten op dat de 10-7 M-concentratie van testosteron de follikelrekrutering, overleving en verhoogde progressie van follikels in een vroeg stadiumverhoogde 19. In 2007 rapporteerden Yang en Fortune met behulp van ovariële cortexculturen van runderfoetussen (5-8 maanden zwangerschap) een rol voor vasculaire endotheliale groeifactor A (VEGFA) in de primaire naar secundaire follikelovergang21. Bovendien heeft ons laboratorium ovariële cortexculturen gebruikt om aan te tonen hoe VEGFA-isovormen (angiogene, antiangiogene en een combinatie) verschillende signaaltransductieroutes kunnen reguleren via de Kinase-domeinreceptor (KDR), de belangrijkste signaaltransductiereceptor die VEGFA bindt16. Deze informatie zorgde voor een beter begrip van hoe verschillende VEGFA-isovormen signaalroutes beïnvloeden om follikelprogressie of -arrestatie uit te lokken. Alles bij elkaar genomen kan het kweken van stukken van de ovariële cortex in vitro met verschillende steroïden of groeifactoren een waardevolle test zijn om effecten te bepalen op mechanismen die folliculogenese reguleren. Evenzo kunnen dieren die zijn ontwikkeld op verschillende voedingsregimes veranderde ovariële micro-omgevingen hebben, die folliculogenese kunnen bevorderen of remmen die de vrouwelijke reproductieve volwassenheid beïnvloedt. Ons doel in het huidige manuscript is dus om de boviene cortexcultuurtechniek te rapporteren en te bepalen of er verschillen zijn in ovariële micro-omgevingen na in vitro cultuur van runderschors van vaarzen die ofwel Control- of Stair-Step-diëten kregen verzameld op de leeftijd van 13 maanden zoals eerder beschreven16.

Daarom was onze volgende stap om de ovariële micro-omgeving te bepalen in deze vaarzen die werden ontwikkeld met verschillende voedingsdiëten. We evalueerden de ovariële cortex van vaarzen die werden gevoed met een Stair-Step- of Control-dieet. Controle vaarzen kregen gedurende 84 dagen een onderhoudsdieet aangeboden van 97,9 g/kg0,75. Het Stair-Step dieet werd gestart na 8 maanden met een beperkt gevoed dieet van 67,4 g/kg0,75 gedurende 84 dagen. Na de eerste 84 dagen, terwijl controle vaarzen 97,9 g / kg0,75 blevenontvangen, kregen de Stair-Step runder vaarzen nog 68 dagen 118,9 g / kg0,75 aangeboden, waarna ze op de leeftijd van 13 maanden16 werden geïnvariectomie voor het bestuderen van veranderingen in folliculaire stadia en morfologie voor en na de kweek. We hebben ook getest op verschillen in steroïden, steroïde metabolieten, chemokines en cytokines die worden uitgescheiden in cortexmedia. Steroïden en andere metabolieten werden gemeten om te bepalen of er directe effecten waren van behandelingen die in vivo en/of in vitro werden uitgevoerd op de levensvatbaarheid en productiviteit van weefsel. Veranderingen in de ovariële micro-omgeving voorafgaand aan en na de kweek zorgden voor een momentopname van het endocriene milieu en folliculogenese voorafgaand aan de kweek en hoe cultuur of behandeling tijdens de kweek de follikelprogressie of -arrestatie beïnvloedt.

Eierstokken werden verzameld nadat ovariectomie werd uitgevoerd in het U.S. Meat Animal Research Center (USMARC) volgens hun IACUC-procedures van Control en Stair-Step vaarzen op de leeftijd van 13 maanden op de leeftijd van16, gereinigd met steriele fosfaatbufferzoutoplossing (PBS) wasbeurten met 0,1% antibioticum om bloed en andere verontreinigingen te verwijderen, overtollig weefsel bijgesneden en vervoerd naar het reproductieve fysiologielaboratorium van de Universiteit van Nebraska-Lincoln (UNL) UNL bij 37 ° C23 . Bij UNL werden stukjes ovariële cortex in kleine vierkante stukjes gesneden (~ 0,5-1 mm3; Figuur 1) en gedurende 7 dagen gekweekt(figuur 2). Histologie werd uitgevoerd op de cortexkweekdia’s voor en na de kweek om follikelsstadia16,24 (figuur 3 en figuur 4) en extracellulaire matrixeiwitten te bepalen die kunnen wijzen op fibrose (Picro-Sirus Red, PSR; Figuur 5). Dit maakte het mogelijk om het effect van in vivo voedingsregimes op follikelstadia te bepalen en maakte vergelijking van 7 dagen ovariële cortex op follikelstadia en follikelprogressie mogelijk. Gedurende de kweek werd het medium dagelijks verzameld en verschoond (ongeveer 70% van de media werd elke dag verzameld; 250 μL / put) zodat dagelijkse hormonen / cytokines / chemokines kunnen worden beoordeeld of samengevoegd gedurende dagen om gemiddelde concentraties te verkrijgen. Steroïden zoals androstenedione (A4) en oestrogeen (E2) kunnen gedurende 3 dagen worden samengevoegd en beoordeeld via radioimmunoassay (RIA; Figuur 6) en gepoold over 4 dagen per dier en getest via High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (HPLC-MS)24,25 ( Tabel1). Cytokine-arrays werden gebruikt om cytokine- en chemokineconcentraties in ovariumschorscultuurmedium26 te beoordelen(tabel 2). Real-time polymerasekettingreactie (RT-PCR) testplaten werden uitgevoerd om genexpressie te bepalen voor specifieke signaaltransductieroutes zoals eerder aangetoond16. Alle steroïde, cytokine, follikelstadium en histologische markers bieden een momentopname van de ovariële micro-omgeving en aanwijzingen over het vermogen van die micro-omgeving om “normale” of “abnormale” folliculogenese te bevorderen.

Protocol

De eierstokken werden verkregen van U. S. Meat Animal Research Center16. Zoals eerder vermeld16, werden alle procedures goedgekeurd door het U.S. Meat Animal Research Center (USMARC) Animal Care and Use Committee in overeenstemming met de gids voor zorg en gebruik van landbouwdieren in landbouwkundig onderzoek en onderwijs. De eierstokken werden naar het Voortplantingslaboratorium van de Universiteit van Nebraska-Lincoln gebracht, waar ze werden verwerkt en gekweekt. <p…

Representative Results

Deze boviene cortex kweekprocedure kan worden gebruikt om een breed scala aan hormoon-, cytokine- en histologische gegevens uit kleine stukjes van de eierstok te bepalen. Kleuring, zoals hematoxyline en eosine (H & E), kan worden gebruikt om de ovariële morfologie te bepalen door middel van follikelstadiëring16,23,31 (figuur 3). Kortom, follikels werden geclassificeerd als primordiaal, wat een eic…

Discussion

Het voordeel van in vitro ovariële cortexcultuur, zoals beschreven in dit manuscript, is dat de follikels zich ontwikkelen in een genormaliseerde omgeving met aangrenzend stroma rond de follikels. De somatische cellen en eicellen blijven intact en er is geschikte cel-tot-cel communicatie als een in vivo model. Ons laboratorium heeft ontdekt dat een 7-daags kweeksysteem representatieve folliculogenese- en steroidogenesegegevens biedt voor de behandeling van de ovariële cortex. Andere ovariële weefselkweekprotocollen he…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit onderzoek werd ondersteund door het National Institute of Food and Agriculture 2013-67015-20965 aan ASC, University of Nebraska Food for Health Competitive Grants aan ASC. United States Department of Agriculture Hatch grant NEB26-202/W3112 Accession #1011127 to ASC, Hatch–NEB ANHL Accession #1002234 to ASC. Quantitative Life Sciences Initiative Summer Postdoctoral Scholar Support – COVID-19 Award voor zomerfinanciering voor CMS.

De auteurs willen graag hun waardering uitspreken voor Dr. Robert Cushman, U.S. Meat Animal Research Center, Clay Center, NE om hem te bedanken voor het verstrekken van de eierstokken in een eerdere publicatie, die vervolgens in het huidige artikel werden gebruikt als een proof of concept bij het valideren van deze techniek.

Materials

#11 Scapel Blade Swann-Morton  303 Scaple Blade
#21 Scapel Blade Swann-Morton  307 Scaple Blade
500mL Bottle Top Filter Corning 430514 Bottle Top Filter 0.22 µm pore for filtering medium
AbsoluteIDQ Sterol17 Assay Biocrates Sterol17 Kit Samples are sent off to Biocrates and steroid panels are run and results are returned 
Androstenedione Double Antibody RIA Kit MPBio 7109202 RIA to determine androstenedione from culture medium
Belgium A4 Assay Kit  DIA Source  KIP0451 RIA to determine androstenedione from culture medium
Bovine Cytokine Array Q3 RayBiotech QAB-CYT-3-1 Cytokine kit to determine cytokines from culture medium
cellSens Software Standard 1.3 Olympus 7790 Imaging Software
Insulin-Transferrin-Selenium-X Gibco ThermoFisher Scientific 5150056 Addative to the culture medium
Leibovitz's L-15 Medium Gibco ThermoFisher Scientific 4130039 Used for tissue washing on clean bench, and in the biosafety cabniet 
Microscope  Olympus SZX16 Disection microscope used for imaging tissue culture pieces 
Microscope Camera  Olympus DP71 Microscope cameraused for imaging tissue culture pieces 
Millicell Cell Culture Inserts 0.4µm, 12,mm Diameter Millipore Sigma PICM01250 Inserts that allow the tissue to rest against the medium without being submerged in it
Multiwell 24 well plate Falcon 353047 Plate used to hold meduim, inserts, and tissues
Petri dish 60 x 15 mm Falcon 351007 Petri dish used for washing steps prior to culture
Phosphate-Buffered Saline (PBS 1X) Corning 21-040-CV Used for tissue washing
SAS Version 9.3 SAS Institute  9.3 TS1M2 Statistical analysis software 
Thomas Stadie-Riggs Tissue Slicer Thomas Scientific 6727C10 Tissue slicer for preperation of thin uniform sections of fresh tissue
Waymouth MB 752/1 Medium Sigma-Aldrich W1625 Medium used for tissue cultures
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Braw-Tal, R., Yossefi, S. Studies in vivo and in vitro on the initiation of follicle growth in the bovine ovary. Journal of Reproduction and Fertility. 109, 165-171 (1997).
  2. Nilsson anEdson, M. A., Nagaraja, A. K., Matzuk, M. M. The mammalian ovary from genesis to revelation. Endocrine Reviews. 30 (6), 624-712 (2009).
  3. Fortune, J. E., Cushman, R. A., Wahl, C. M., Kito, S. The primordial to primary follicle transition. Molecular and Cellular Endocrinology. 163, 53-60 (2000).
  4. Ireland, J. J. Control of follicular growth and development. Journal of Reproduction and Fertility. 34, 39-54 (1987).
  5. Higuchi, C. M., Maeda, Y., Horiuchi, T., Yamazaki, Y. A simplified method for three-dimensional (3-D) ovarian tissue culture yielding oocytes competent to produce full-term offspring in mice. PLoS One. 10 (11), e0143114 (2015).
  6. Ramezani, M., Salehnia, M., Jafarabadi, M. Short term culture of vitrified human ovarian cortical tissue to assess the cryopreservation outcome: molecular and morphological analysis. Journal of Reproduction & Infertility. 18 (1), 162-171 (2017).
  7. McLaughlin, M., Telfer, E. Oocyte development in bovine primordial follicles is promoted by activin and FSH within a two-step serum-free culture system. Reproduction. 139 (6), 971-978 (2010).
  8. Stefansdottir, A., Fowler, P. A., Powles-Glover, N., Anderson, R. A., Spears, N. Use of ovary culture techniques in reproductive toxicology. Reproductive Toxicology. 49, 117-135 (2014).
  9. Bromfield, J. J., Sheldon, I. M. Lipopolysaccharide reduces the primordial follicle pool in the bovine ovarian cortex ex vivo and in the murine ovary in vivo. Biology of Reproduction. 88 (4), 1-9 (2013).
  10. Franks, S., Stark, J., Hardy, K. Follicle dynamics and anovulation in polycystic ovary syndrome. Humane Reproduction Update. 14 (4), 367-378 (2008).
  11. Desmeules, P., Devine, P. J. Characterizing the ovotoxicity of cyclophosphamide metabolites on cultured mouse ovaries. Toxicological Sciences. 90 (2), 500-509 (2006).
  12. Bott, R. C., McFee, R. M., Clopton, D. T., Toombs, C., Cupp, A. S. Vascular endothelial growth factor and kinase domain region receptor are involved in both seminiferous cord formation and vascular development during testis morphogenesis in the rat. Biology of Reproduction. 75, 56-67 (2006).
  13. Baltes-Breitwisch, M. M., et al. Neutralization of vascular endothelial growth factor antiangiogenic isoforms or administration of proangiogenic isoforms stimulates vascular development in the rat testis. Reproduction. 140 (2), 319-329 (2010).
  14. McFee, R. M., et al. Inhibition of vascular endothelial growth factor receptor signal transduction blocks follicle progression but does not necessarily disrupt vascular development in perinatal rat ovaries. Biology of Reproduction. 81, 966-977 (2009).
  15. Artac, R. A., et al. Neutralization of vascular endothelial growth factor antiangiogenic isoforms is more effective than treatment with proangiogenic isoforms in stimulating vascular development and follicle progression in the perinatal rat ovary. Biology of Reproduction. 81, 978-988 (2009).
  16. Abedal-Majed, M. A., et al. Vascular endothelial growth factor A isoforms modulate follicle development in peripbertal heifers independent of diet through diverse signal transduction pathways. Biology of Reproduction. 102 (3), 680-692 (2020).
  17. Wandji, S. A., Srsen, V., Voss, A. K., Eppig, J. J., Fortune, J. E. Initiation in vitro of bovine primordial follicles. Biology of Reproduction. 55, 942-948 (1996).
  18. Wandji, S. A., Srsen, V., Nathanielsz, P. W., Eppig, J. J., Fortune, J. E. Initiation of growth of baboon primordial follicles in vitro. Human Reproduction. 12 (9), 1993-2001 (1993).
  19. Yang, M. Y., Fortune, J. E. Testosterone stimulates the primary to secondary follicle transition in bovine follicles in vitro. Biology of Reproduction. 75, 924-932 (2006).
  20. Fortune, J. E., Kito, S., Wandji, S. A., Srsen, V. Activation of bovine and baboon primordial follicles in vitro. Theriogenology. 49, 441-449 (1998).
  21. Yang, M. Y., Fortune, J. E. Vascular endothelial growth factor stimulates the primary to secondary follicle transition in bovine follicles in vitro. Molecular Reproduction and Development. 74, 1095-1104 (2007).
  22. Barberino, R. S., Silva, J. R. V., Figueiredo, J. R., Matos, M. H. T. Transport of domestic and wild animal ovaries: a review of the effects of medium, temperature, and periods of storage on follicular viability. Biopreservation and Biobanking. 17 (1), 84-90 (2019).
  23. Summers, A. F., et al. Altered theca and cumulus oocyte complex gene expression, follicular arrest and reduced fertility in cows with dominant follicle follicular fluid androgen excess. PLoS One. 9 (10), e110683 (2014).
  24. Koal, T., Schmiederer, D., Pham-Tuan, H., Rohring, C., Rauh, M. Standardized LC-MS/MS based steroid hormone profile analysis. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 129, 129-138 (2012).
  25. Poole, R. K., Brown, A. R., Pore, M. H., Pickworth, C. L., Poole, D. H. Effects of endophyte-infected tall fescue seed and protein supplementation on stocker steers: II. Adaptive and innate immune function. Journal of Animal Science. 97 (10), 4160-4170 (2019).
  26. Laronda, M., et al. Alginate encapsulation supports the growth and differentiation of human primordial follicles within ovarian cortical tissue. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 31 (8), 1013-1028 (2014).
  27. Silber, S. J., et al. A series of monozygotic twins discordant for ovarian failure: ovary transplantation (cortical versus microvascular) and cryopreservation. Human Reproduction. 23 (7), 1531-1537 (2008).
  28. Wiedemann, C., Zahmel, J., Jewgenow, K. Short-term culture of ovarian cortex pieces to assess the cryopreservation outcome in wild fields for genome conservation. BMC Veterinary Research. 9 (37), (2013).
  29. Baufeld, A., Vanselow, J. Increasing cell plating density mimics an early post-LH stage in cultured bovine granulosa cells. Cell and Tissue Research. 354 (3), 869-880 (2013).
  30. Shimizu, T., Miyamoto, A. Progesterone induces the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) 120 and Flk-1, its receptor, in bovine granulosa cells. Animal Reproduction Science. 102 (3-4), 228-237 (2007).
  31. Tepekoy, F., Akkoyunlu, G. The effect of FSH and activin A on Akt and MAPK1/3 phosphorylation in cultured bovine ovarian cortical strips. Journal of Ovarian Research. 9 (13), 1-9 (2016).
  32. Beck, K., Singh, J., Arshud Dar, M., Anzar, M. Short-term culture of adult bovine ovarian tissues: chorioallantoic membrane (CAM) vs. traditional in vitro culture systems. Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (1), 21 (2018).
  33. Eppig, J. J. Oocyte control of ovarian follicular development and function in mammals. Reproduction. 122 (6), 829-838 (2001).
  34. Paczkowski, M., Silva, E., Schoolcraft, W. B., Krisher, R. L. Comparative importance of fatty acid beta-oxidation to nuclear maturation, gene expression, and glucose metabolism in mouse, bovine, and porcine cumulus oocyte complexes. Biology of Reproduction. 88 (5), 1-11 (2013).
  35. Raffel, N., et al. Is ovarian tissue transport at supra-zero temperatures compared to body temperature optimal for follicle survival?. In Vivo. 34 (2), 533-541 (2020).
  36. Duncan, F., et al. Ovarian tissue transport to expand access to fertility preservation: from animals to clinical practice. Reproduction (Cambridge, England). 152 (6), R201-R210 (2016).
  37. Liebenthron, J., et al. Overnight ovarian tissue transportation for centralized cryobanking: a feasible option. Reproductive BioMedicine Online. 38 (5), 740-749 (2019).
  38. Mohammed, B. T., Donadeu, F. X. Bovine granulosa cell culture. Epithelial Cell Culture: Methods and Protocols. , 79-87 (2018).
  39. Langbeen, A., et al. Effects of neutral red assisted viability assessment on the cryotolerance of isolated bovine preantral follicles. Journal of Assisted Reproduction Genetics. 31, 1727-1736 (2014).
  40. Higuchi, C. M., Maeda, Y., Horiuchi, T., Yamazaki, Y. A simplified method for three-dimensional (3-D) ovarian tissue culture yielding oocytes competent to produce full-term offspring in mice. PLoS One. 10 (11), e0143114 (2015).
  41. Yang, M. Y., Fortune, J. E. Changes in the transcriptome of bovine ovarian cortex during follicle activation in vitro. Physiological Genomics. 47, 600-611 (2015).

Tags

Keywords: Bovine Ovarian CortexFollicle GrowthSteroidogenesisImmune MoleculesReproductive DisordersPolycystic Ovarian SyndromeOvarian MicroenvironmentIn Vitro Examination
check_url/kr/61668?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Sutton, C. M., Springman, S. A., Abedal-Majed, M. A., Cupp, A. S. Bovine Ovarian Cortex Tissue Culture. J. Vis. Exp. (167), e61668, doi:10.3791/61668 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image