Культура ткани коры яичников крупного рогатого скота

Summary

Представлена культура in vitro коры яичников крупного рогатого скота и влияние питательной лестничной диеты на микроокружение яичников. Кусочки коры яичников культивировали в течение семи дней, оценивали стероиды, цитокины и стадии фолликулов. Диетическое лечение Stair-Step увеличило стероидогенез, что привело к прогрессированию фолликулов в культуре.

Abstract

Развитие фолликула от первичной до антральной стадии – это динамический процесс внутри коры яичников, который включает эндокринные и паракринные факторы из соматических клеток и кучевые клеточно-ооцитарные коммуникации. Мало что известно о микроокружении яичников и о том, как цитокины и стероиды, вырабатываемые в окружающей среде, влияют на прогрессирование или остановку фолликулов. Культура in vitro коры яичников позволяет фолликулам развиваться в нормализованной среде, которая остается поддерживаемой соседней стромой. Наша цель состояла в том, чтобы определить влияние питательной диеты Stair-Step на микроокружение яичников (развитие фолликулов, выработку стероидов и цитокинов) с помощью культуры in vitro коры яичников крупного рогатого скота. Чтобы достичь этого, корковые части яичников были удалены у телок, проходящих две различные схемы питания до полового созревания: Контроль (традиционное развитие питания) и Ступенька (кормление и ограничение во время развития), которые были разрезаны примерно на 0,5-1 мм³ кусочка. Эти кусочки впоследствии были пропущены через серию промывок и размещены на тканевой культуральной вставке, которая устанавливается в колодец, содержащий культуральную среду Уэймута. Кора яичников культивировалась в течение 7 дней с ежедневными изменениями питательных сред. Гистологическое сечение проводили для определения изменений стадии фолликула до и после посева для определения эффектов питания и воздействия культуры без дополнительного лечения. Культуральная среда cortex была объединена в течение нескольких дней для измерения стероидов, стероидных метаболитов и цитокинов. Наблюдались тенденции к увеличению стероидных гормонов в микроокружении яичников, что позволило прогрессировать фолликулы в культурах Stair-Step по сравнению с культурами коры яичников. Метод культивирования коры яичников позволяет лучше понять микроокружение яичников и то, как изменения в эндокринной секреции могут влиять на прогрессирование и рост фолликулов как при лечении in vivo, так и in vitro. Этот метод культивирования может также оказаться полезным для тестирования потенциальных терапевтических средств, которые могут улучшить прогрессирование фолликулов у женщин для повышения фертильности.

Introduction

Кора яичников представляет собой внешний слой яичника, где происходит развитие фолликула^1. Примордиальные фолликулы, первоначально остановленные в развитии, будут активированы, чтобы стать первичными, вторичными, а затем антральными или третичными фолликулами на основе паракринных и гонадотропиновых входов^1,2,3,4. Чтобы лучше понять физиологические процессы в яичнике, культура тканей может быть использована в качестве модели in vitro, что позволяет контролируемой среде проводить эксперименты. Многие исследования использовали культуру ткани яичников для исследований в области вспомогательных репродуктивных технологий, сохранения фертильности и рака яичников^5,6,7. Культура ткани яичников также послужила моделью для исследования репродуктивных токсинов, которые повреждают здоровье яичников и этиологию репродуктивных расстройств, таких как синдром поликистозных яичников (СПКЯ)^8,9,10,11. Таким образом, эта система культур применима к широкому спектру специальностей.

У грызунов цельные фетальные или перинатальные гонады использовались в экспериментах по репродуктивной биологии^12,13,14,15. Однако гонады более крупного домашнего скота не могут культивироваться как целые органы из-за их большого размера и потенциальной дегенерации. Поэтому кору яичников крупного рогатого скота и нечеловеческого примата разрезают на более мелкие кусочки^16,17,18. Во многих исследованиях культивировались небольшие кусочки коры яичников для изучения различных факторов роста в инициации первичного фолликула у домашнего скота и нечеловеческих приматов^1,17,18,19. Использование культуры коры яичников также продемонстрировало инициацию первичного фолликула при отсутствии сыворотки для кортикальных кусочков крупного рогатого скота и приматов, культивируемых в течение 7^{дней 20.} Янг и Фортуна в 2006 году лечили культуральную среду коры яичников плода диапазоном доз тестостерона в течение 10 дней и наблюдали, что концентрация тестостерона^{10 -7 М} увеличивает набор фолликулов, выживаемость и увеличивает прогрессирование фолликулов на ранней стадии^19. В 2007 году, используя культуры коры яичников крупного рогатого скота (5-8 месяцев беременности), Ян и Фортуна сообщили о роли фактора роста эндотелия сосудов А (VEGFA) в первичном переходе фолликула на вторичный^21. Кроме того, наша лаборатория использовала культуры коры яичников, чтобы продемонстрировать, как изоформы VEGFA (ангиогенные, антиангиогенные и комбинированные) могут регулировать различные пути сигнальной трансдукции через рецептор киназного домена (KDR), который является основным сигнальным рецептором трансдукции, который VEGFA связывает^16. Эта информация позволила лучше понять, как различные изоформы VEGFA влияют на сигнальные пути, вызывая прогрессирование или остановку фолликулов. В совокупности культивирование кусочков коры яичников in vitro с различными стероидами или факторами роста может быть ценным анализом для определения влияния на механизмы, регулирующие фолликулогенез. Аналогичным образом, животные, которые развиваются на разных режимах питания, могут иметь измененное микроокружение яичников, что может способствовать или ингибировать фолликулогенез, влияющий на репродуктивную зрелость самок. Таким образом, наша цель в текущей рукописи состоит в том, чтобы сообщить о методе культивирования коры крупного рогатого скота и определить, есть ли различия в микросредах яичников после культуры in vitro коры крупного рогатого скота от телок, которых кормили либо контрольной, либо степенной диетой, собранной в возрасте 13 месяцев, как описано^{ранее 16.}

Поэтому нашим следующим шагом было определение микроокружения яичников у этих телок, которые были разработаны с различными питательными диетами. Мы оценили кору яичников у телок, которых кормили либо лестничной, либо контрольной диетой. Контрольным телкам предлагалась поддерживающая диета 97,9 г/кг^0,75 в течение 84 дней. Диета Stair-Step была начата через 8 месяцев, содержащая ограниченную диету 67,4 г / кг^0,75 в течение 84 дней. После первых 84 дней, в то время как контрольные телки продолжали получать 97,9 г/кг^0,75,говяжьим телкам Stair-Step предлагали 118,9 г/кг^0,75 в течение еще 68 дней, после чего их овариэктомировали в возрасте 13 месяцев¹⁶ лет для изучения изменений в фолликулярных стадиях и морфологии до и после культивирования. Мы также проанализировали различия в стероидах, стероидных метаболитах, хемокинах и цитокинах, секретируемых в среды коры головного мозга. Стероиды и другие метаболиты измеряли, чтобы определить, были ли какие-либо прямые эффекты от лечения, проводимого in vivo и / или in vitro, на жизнеспособность и продуктивность тканей. Изменения в микроокружении яичников до и после культивирования обеспечили снимок эндокринной среды и фолликулогенеза до посева и того, как культура или лечение во время культуры влияет на прогрессирование или остановку фолликулов.

Яичники были собраны после того, как овариэктомия была выполнена в Исследовательском центре мясных животных США (USMARC) в соответствии с их процедурами IACUC от контрольных и лестничных телок в возрасте 13 месяцев¹⁶лет, очищенных стерильным фосфатным буферным физиологическим раствором (PBS), промытых 0,1% антибиотиком для удаления крови и других загрязняющих веществ, обрезанных излишков ткани и транспортированных в лабораторию репродуктивной физиологии Университета Небраски-Линкольна (UNL) UNL при 37 ° C²³ . В UNL кусочки коры яичников разрезали на мелкие квадратные кусочки (~0,5-1^мм3; Рисунок 1) и культивируется в течение 7 дней(рисунок 2). Гистология проводилась на слайдах культуры коры головного мозга до и после посева для определения фолликулов^{стадий 16,24} (Фиг.3 и Фиг.4),а также белков внеклеточного матрикса, которые могут указывать на фиброз (Picro-Sirus Red, PSR; Рисунок 5). Это позволило определить влияние режимов питания in vivo на стадии фолликула и позволило сравнить 7 дней коры яичников на стадиях фолликула и прогрессирование фолликулов. На протяжении всей культуры среду собирали и изменяли ежедневно (примерно 70% сред собирали каждый день; 250 мкл / хорошо), так что либо суточные гормоны / цитокины / хемокины могли быть оценены, либо объединены в течение нескольких дней для получения средних концентраций. Стероиды, такие как андростендион (A4) и эстроген (E2), могут быть объединены в течение 3 дней и оценены с помощью радиоиммуноанализа (RIA; Рисунок 6) и объединенные в течение 4 дней на каждое животное и проанализированные с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (ВЭЖХ-МС)^24,25 (таблица 1). Цитокиновые массивы использовали для оценки концентраций цитокинов и хемокинов в культуральной среде коры яичников²⁶ (таблица 2). Были проведены тестовые пластины полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) в режиме реального времени для определения экспрессии генов для специфических путей трансдукции сигнала, как было продемонстрировано^{ранее 16.} Все стероидные, цитокиновые, фолликулярные стадии и гистологические маркеры обеспечивают снимок микроокружения яичников и подсказки о способности этого микроокружения способствовать «нормальному» или «аномальному» фолликулогенезу.

Protocol

Яичники были получены из Исследовательского центра мясных животных США16. Как указывалосьранее 16,все процедуры были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Центра исследований мясных животных США (USMARC) в соответствии с руководством по уходу и исп…

Representative Results

Эта процедура культивирования коры крупного рогатого скота может быть использована для определения широкого спектра гормональных, цитокинных и гистологических данных из небольших кусочков яичника. Окрашивание, такое как гематоксилин и эозин (H & E), может быть использовано для определ?…

Discussion

Преимущество культуры коры яичников in vitro, как описано в этой рукописи, заключается в том, что фолликулы развиваются в нормализованной среде с прилегающей стромой, окружающей фолликулы. Соматические клетки и ооцит остаются нетронутыми, и существует соответствующая межклеточная связь ?…

Materials

#11 Scapel Blade	Swann-Morton	303	Scaple Blade
#21 Scapel Blade	Swann-Morton	307	Scaple Blade
500mL Bottle Top Filter	Corning	430514	Bottle Top Filter 0.22 µm pore for filtering medium
AbsoluteIDQ Sterol17 Assay	Biocrates	Sterol17 Kit	Samples are sent off to Biocrates and steroid panels are run and results are returned
Androstenedione Double Antibody RIA Kit	MPBio	7109202	RIA to determine androstenedione from culture medium
Belgium A4 Assay Kit	DIA Source	KIP0451	RIA to determine androstenedione from culture medium
Bovine Cytokine Array Q3	RayBiotech	QAB-CYT-3-1	Cytokine kit to determine cytokines from culture medium
cellSens Software Standard 1.3	Olympus	7790	Imaging Software
Insulin-Transferrin-Selenium-X	Gibco ThermoFisher Scientific	5150056	Addative to the culture medium
Leibovitz's L-15 Medium	Gibco ThermoFisher Scientific	4130039	Used for tissue washing on clean bench, and in the biosafety cabniet
Microscope	Olympus	SZX16	Disection microscope used for imaging tissue culture pieces
Microscope Camera	Olympus	DP71	Microscope cameraused for imaging tissue culture pieces
Millicell Cell Culture Inserts 0.4µm, 12,mm Diameter	Millipore Sigma	PICM01250	Inserts that allow the tissue to rest against the medium without being submerged in it
Multiwell 24 well plate	Falcon	353047	Plate used to hold meduim, inserts, and tissues
Petri dish 60 x 15 mm	Falcon	351007	Petri dish used for washing steps prior to culture
Phosphate-Buffered Saline (PBS 1X)	Corning	21-040-CV	Used for tissue washing
SAS Version 9.3	SAS Institute	9.3 TS1M2	Statistical analysis software
Thomas Stadie-Riggs Tissue Slicer	Thomas Scientific	6727C10	Tissue slicer for preperation of thin uniform sections of fresh tissue
Waymouth MB 752/1 Medium	Sigma-Aldrich	W1625	Medium used for tissue cultures