Cultivo de tejido de corteza ovárica bovina
Summary
Se presenta el cultivo in vitro de la corteza ovárica bovina y el efecto de la dieta nutricional Stair-step sobre el microambiente ovárico. Las piezas de la corteza ovárica se cultivaron durante siete días y se evaluaron los esteroides, las citoquinas y las etapas del folículo. El tratamiento de la dieta Stair-Step había aumentado la esteroidogénesis, lo que resultó en la progresión del folículo en cultivo.
Abstract
El desarrollo del folículo desde la etapa primordial hasta la antral es un proceso dinámico dentro de la corteza ovárica, que incluye factores endocrinos y paracrinos de las células somáticas y la comunicación cúmulo célula-ovocito. Poco se sabe sobre el microambiente ovárico y cómo las citoquinas y esteroides producidos en el entorno circundante afectan la progresión o detención del folículo. El cultivo in vitro de la corteza ovárica permite que los folículos se desarrollen en un entorno normalizado que permanece soportado por el estroma adyacente. Nuestro objetivo fue determinar el efecto de la dieta nutricional Stair-Step sobre el microambiente ovárico (desarrollo del folículo, producción de esteroides y citoquinas) a través del cultivo in vitro de la corteza ovárica bovina. Para lograr esto, se retiraron piezas corticales ováricas de novillas sometidas a dos esquemas nutricionalmente desarrollados diferentes antes de la pubertad: Control (desarrollo de la nutrición tradicional) y Stair-Step (alimentación y restricción durante el desarrollo) que se cortaron en aproximadamente 0.5-1 mm3 pedazos. Estas piezas se pasaron posteriormente a través de una serie de lavados y se colocaron en un inserto de cultivo de tejidos que se coloca en un pozo que contiene el medio de cultivo de Waymouth. La corteza ovárica se cultivó durante 7 días con cambios diarios en los medios de cultivo. Se realizó un seccionamiento histológico para determinar los cambios en el estadio del folículo antes y después del cultivo para determinar los efectos de la nutrición y el impacto del cultivo sin tratamiento adicional. El medio de cultivo Cortex se agrupó durante días para medir esteroides, metabolitos esteroides y citoquinas. Hubo tendencias para el aumento de las hormonas esteroides en el microambiente ovárico que permitieron la progresión del folículo en los cultivos de corteza ovárica Stair-Step versus Control. La técnica de cultivo de la corteza ovárica permite una mejor comprensión del microambiente ovárico y cómo las alteraciones en la secreción endocrina pueden afectar la progresión y el crecimiento del folículo tanto a partir de tratamientos in vivo como in vitro. Este método de cultivo también puede resultar beneficioso para probar posibles terapias que pueden mejorar la progresión del folículo en las mujeres para promover la fertilidad.
Introduction
La corteza ovárica representa la capa externa del ovario donde se produce el desarrollo del folículo1. Los folículos primordiales, inicialmente detenidos en desarrollo, se activarán para convertirse en folículos primarios, secundarios y luego antrales o terciarios basados en entradas paracrinas y gonadotropinas1,2,3,4. Para comprender mejor los procesos fisiológicos dentro del ovario, el cultivo de tejidos se puede utilizar como un modelo in vitro, lo que permite un entorno controlado para realizar experimentos. Muchos estudios han utilizado el cultivo de tejido ovárico para la investigación en tecnología de reproducción asistida, preservación de la fertilidad y cáncer de ovario5,6,7. El cultivo de tejido ovárico también ha servido como modelo para investigar las toxinas reproductivas que dañan la salud ovárica y la etiología de trastornos reproductivos como el Síndrome de Ovario Poliquístico (SOP)8,9,10,11. Por lo tanto, este sistema de cultivo es aplicable a una amplia gama de especialidades.
En roedores, se han utilizado gónadas fetales o perinatales enteras en experimentos de biología reproductiva12,13,14,15. Sin embargo, las gónadas del ganado doméstico más grande no se pueden cultivar como órganos completos debido a su gran tamaño y posible degeneración. Por lo tanto, la corteza ovárica bovina y primate no humana se corta en trozos más pequeños16,17,18. Muchos estudios han cultivado pequeñas piezas de corteza ovárica para estudiar varios factores de crecimiento en la iniciación del folículo primordial en ganado doméstico y primates no humanos1,17,18,19. El uso del cultivo de corteza ovárica también ha demostrado la iniciación del folículo primordial en ausencia de suero para piezas corticales bovinas y primates cultivadas durante 7 días20. Yang y Fortune en 2006 trataron el medio de cultivo de corteza ovárica fetal con un rango de dosis de testosterona durante 10 días y observaron que la concentración de testosterona de 10-7 M aumentó el reclutamiento del folículo, la supervivencia y el aumento de la progresión de los folículos en etapa temprana19. En 2007, utilizando cultivos de corteza ovárica de fetos bovinos (5-8 meses de gestación), Yang y Fortune informaron un papel para el Factor de Crecimiento Endotelial Vascular A (VEGFA) en la transición del folículo primario a secundario21. Además, nuestro laboratorio ha utilizado cultivos de corteza ovárica para demostrar cómo las isoformas VEGFA (angiogénicas, antiangiogénicas y una combinación) pueden regular diferentes vías de transducción de señales a través del receptor del dominio quinasa (KDR), que es el principal receptor de transducción de señales al que se une VEGFA16. Esta información permitió una mejor comprensión de cómo las diferentes isoformas de VEGFA afectan las vías de señalización para provocar la progresión o detención del folículo. En conjunto, el cultivo de piezas de corteza ovárica in vitro con diferentes esteroides o factores de crecimiento puede ser un ensayo valioso para determinar los efectos sobre los mecanismos que regulan la foliculogénesis. Del mismo modo, los animales que se desarrollan en diferentes regímenes nutricionales pueden tener microambientes ováricos alterados, lo que puede promover o inhibir la foliculogénesis que afecta la madurez reproductiva femenina. Por lo tanto, nuestro objetivo en el manuscrito actual es informar sobre la técnica de cultivo de corteza bovina y determinar si existen diferencias en los microambientes ováricos después del cultivo in vitro de la corteza bovina a partir de novillas alimentadas con dietas Control o Stair-Step recolectadas a los 13 meses de edad como se describió anteriormente16.
Por lo tanto, nuestro siguiente paso fue determinar el microambiente ovárico en estas novillas que se desarrollaron con diferentes dietas nutricionales. Evaluamos la corteza ovárica de novillas alimentadas con una dieta Stair-Step o Control. A las novillas de control se les ofreció una dieta de mantenimiento de 97,9 g/kg0,75 durante 84 días. La dieta Stair-Step se inició a los 8 meses conteniendo una dieta restringida de 67,4 g/kg0,75 durante 84 días. Después de los primeros 84 días, mientras que las novillas control continuaron recibiendo 97,9 g/kg0,75,a las novillas de carne de res Stair-Step se les ofreció 118,9 g/kg0,75 durante otros 68 días, después de lo cual fueron ovariectomizadas a los 13 meses de edad de16 años para estudiar los cambios en las etapas foliculares y la morfología antes y después del cultivo. También se analizaron las diferencias en los esteroides, metabolitos esteroides, quimiocinas y citoquinas secretadas en los medios de la corteza. Se midieron los esteroides y otros metabolitos para determinar si hubo algún efecto directo de los tratamientos realizados in vivo y/o in vitro sobre la viabilidad y productividad de los tejidos. Los cambios en el microambiente ovárico antes y después del cultivo proporcionaron una instantánea del medio endocrino y la foliculogénesis antes del cultivo y cómo el cultivo o el tratamiento durante el cultivo afecta la progresión o detención del folículo.
Los ovarios se recolectaron después de que se realizaron ovariectomías en el Centro de Investigación de Animales de Carne de los Estados Unidos (USMARC) de acuerdo con sus procedimientos IACUC de novillas de control y escalonadas a los 13 meses de edad de16años, limpiadas con lavados estériles de solución salina tampón de fosfato (PBS) con 0.1% de antibiótico para eliminar sangre y otros contaminantes, recortaron el exceso de tejido y se transportaron al laboratorio de Fisiología Reproductiva de la Universidad de Nebraska-Lincoln (UNL) UNL a 37 ° C23 . En la UNL, las piezas de la corteza ovárica se cortaron en pequeños trozos cuadrados (~ 0.5-1 mm3; Figura 1) y cultivado durante 7 días (Figura 2). La histología se realizó en las diapositivas de cultivo de la corteza antes y después del cultivo para determinar los folículos en las etapas16,24 (Figura 3 y Figura 4),y las proteínas de la matriz extracelular que pueden indicar fibrosis (Picro-Sirus Red, PSR; Figura 5). Esto permitió la determinación del efecto de los regímenes nutricionales in vivo en las etapas del folículo y permitió la comparación de 7 días de corteza ovárica en las etapas del folículo y la progresión del folículo. A lo largo del cultivo, el medio se recolectó y cambió diariamente (aproximadamente el 70% de los medios se recolectaron cada día; 250 μL / pozo) para que las hormonas / citoquinas / quimiocinas diarias puedan evaluarse o agruparse durante días para obtener concentraciones promedio. Los esteroides como la androstenediona (A4) y el estrógeno (E2) se pueden agrupar durante 3 días y evaluarse a través de radioinmunoensayo (RIA; Figura 6) y agrupados durante 4 días por animal y ensayados mediante Cromatografía Líquida de Alto Rendimiento-Espectrometría de Masas (HPLC-MS)24,25 ( Tabla1). Se utilizaron matrices de citoquinas para evaluar las concentraciones de citoquinas y quimiocinas en el medio de cultivo de la corteza ovárica26 (Tabla 2). Se realizaron placas de ensayo de reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) en tiempo real para determinar la expresión génica de vías de transducción de señales específicas, como se demostró anteriormente16. Todos los marcadores de esteroides, citoquinas, etapas foliculares e histológicos proporcionan una instantánea del microambiente ovárico y pistas sobre la capacidad de ese microambiente para promover la foliculogénesis “normal” o “anormal”.
Protocol
Representative Results
Discussion
El beneficio del cultivo in vitro de corteza ovárica, como se describe en este manuscrito, es que los folículos se desarrollan en un ambiente normalizado con estroma adyacente que rodea los folículos. Las células somáticas y los ovocitos permanecen intactos, y existe una comunicación apropiada de célula a célula como modelo in vivo. Nuestro laboratorio ha encontrado que un sistema de cultivo de 7 días proporciona datos representativos de foliculogénesis y esteroidogénesis para el tratamiento de la corteza ová…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue apoyada por el Instituto Nacional de Alimentos y Agricultura 2013-67015-20965 a ASC, University of Nebraska Food for Health Competitive Grants to ASC. Subvención neb26-202/W3112 adhesión del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos #1011127 a ASC, Hatch–NEB ANHL Adhesión #1002234 a ASC. Quantitative Life Sciences Initiative Summer Postdoctoral Scholar Support – Premio COVID-19 para la financiación de verano para CMS.
Los autores desean extender su agradecimiento al Dr. Robert Cushman, U.S. Meat Animal Research Center, Clay Center, NE para agradecerle por proporcionar los ovarios en una publicación anterior, que luego se utilizaron en el artículo actual como prueba de concepto para validar esta técnica.
Materials
| #11 Scapel Blade | Swann-Morton | 303 | Scaple Blade |
| #21 Scapel Blade | Swann-Morton | 307 | Scaple Blade |
| 500mL Bottle Top Filter | Corning | 430514 | Bottle Top Filter 0.22 µm pore for filtering medium |
| AbsoluteIDQ Sterol17 Assay | Biocrates | Sterol17 Kit | Samples are sent off to Biocrates and steroid panels are run and results are returned |
| Androstenedione Double Antibody RIA Kit | MPBio | 7109202 | RIA to determine androstenedione from culture medium |
| Belgium A4 Assay Kit | DIA Source | KIP0451 | RIA to determine androstenedione from culture medium |
| Bovine Cytokine Array Q3 | RayBiotech | QAB-CYT-3-1 | Cytokine kit to determine cytokines from culture medium |
| cellSens Software Standard 1.3 | Olympus | 7790 | Imaging Software |
| Insulin-Transferrin-Selenium-X | Gibco ThermoFisher Scientific | 5150056 | Addative to the culture medium |
| Leibovitz's L-15 Medium | Gibco ThermoFisher Scientific | 4130039 | Used for tissue washing on clean bench, and in the biosafety cabniet |
| Microscope | Olympus | SZX16 | Disection microscope used for imaging tissue culture pieces |
| Microscope Camera | Olympus | DP71 | Microscope cameraused for imaging tissue culture pieces |
| Millicell Cell Culture Inserts 0.4µm, 12,mm Diameter | Millipore Sigma | PICM01250 | Inserts that allow the tissue to rest against the medium without being submerged in it |
| Multiwell 24 well plate | Falcon | 353047 | Plate used to hold meduim, inserts, and tissues |
| Petri dish 60 x 15 mm | Falcon | 351007 | Petri dish used for washing steps prior to culture |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS 1X) | Corning | 21-040-CV | Used for tissue washing |
| SAS Version 9.3 | SAS Institute | 9.3 TS1M2 | Statistical analysis software |
| Thomas Stadie-Riggs Tissue Slicer | Thomas Scientific | 6727C10 | Tissue slicer for preperation of thin uniform sections of fresh tissue |
| Waymouth MB 752/1 Medium | Sigma-Aldrich | W1625 | Medium used for tissue cultures |
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