عرض للمجمعات غير المتجانسة التي شكلتها بروتينات غشاء Golgi-Resident من النوع الثالث باستخدام فحص تكملة Split Luciferase
Summary
يهدف البروتوكول المعروض هنا إلى إثبات حدوث تفاعلات غير متجانسة بين بروتينات الغشاء من النوع الثالث المقيمة في غولجي مع N- و / أو C-termini المعرضة للسيتوبلازما في خلايا الثدييات الحية باستخدام أحدث متغير من فحص تكملة luciferase المنقسمة.
Abstract
الهدف من هذا البروتوكول هو استكشاف إمكانية تطبيق أحدث متغير من تكملة لوسيفيراز المنقسمة لإظهار المجمعات غير المتجانسة التي شكلتها ناقلات السكر النيوكليوتيدات (NSTs). تحمل هذه البروتينات متعددة الأغشية المقيمة في ER- و Golgi سكريات النيوكليوتيد المركبة من السيتوبلازم عبر أغشية العضيات لتزويد الإنزيمات التي تتوسط في الغليكوزيل مع ركائزها. توجد NSTs كدايمرات و / أو أوليغومرات أعلى. كما تم الإبلاغ عن تفاعلات غير متجانسة بين NSTs المختلفة. للتحقق مما إذا كانت هذه التقنية مناسبة لدراسة ظاهرة التباين NST ، اختبرناها مقابل مزيج من NSTs المقيمين في Golgi والتي ثبت سابقا أنها مرتبطة بعدة وسائل أخرى. يبدو أن اختبار تكملة luciferase مناسب بشكل خاص لدراسة التفاعلات بين بروتينات الغشاء المقيمة في Golgi ، لأنه لا يتطلب مستويات تعبير عالية ، والتي غالبا ما تؤدي إلى سوء توطين البروتين وتزيد من خطر الإيجابيات الكاذبة.
Introduction
تصف هذه المخطوطة بروتوكولا خطوة بخطوة للتحقق من وجود تفاعلات غير متجانسة بين بروتينات الغشاء من النوع الثالث المقيمة في غولجي في الخلايا البشرية المنقولة بشكل عابر باستخدام أحدث متغير من فحص تكملة لوسيفيراز المنقسمة. تم اختبار الإجراء على نطاق واسع ضد ناقلات السكر النيوكليوتيدات (NSTs) ولكننا تمكنا أيضا من الحصول على نتائج إيجابية لبروتينات الغشاء الأخرى من النوع الثالث المقيمة في غولجي والتي تواجه N- و / أو C-termini السيتوبلازم.
تستكشف مجموعتنا البحثية دور NSTs في غليكوزيل الجزيئات الكبيرة. NSTs هي بروتينات غشائية من النوع الثالث من Golgi و / أو ER مع N- و C-termini تواجه الجانب السيتوبلازمي من الغشاء العضوي 1. يعتقد أن NSTs تحمل السكريات المنشطة بالنيوكليوتيدات عبر أغشية العضيات لتزويد الجليكوسيل ترانسفيراز بركائزها. تشكل NSTs dimers و / أو oligomers أعلى 2,3,4,5,6,7,8,9,10. علاوة على ذلك ، تم الإبلاغ أيضا عن تفاعلات غير متجانسة بين NSTs المختلفة 6,11. كما ثبت أن NSTs تشكل مجمعات مع إنزيمات غليكوزيل ذات صلة وظيفية12،13،14. بحثنا عن بديل للتقنية المستخدمة حاليا ، نهج FRET القائم على التصوير الفلوري مدى الحياة (FLIM) ، لدراسة تفاعلات NSTs والبروتينات المقيمة في Golgi ذات الصلة وظيفيا ، لذلك قررنا اختبار اختبار اختبار اختبار تكامل luciferase المنقسم. سمح لنا بتحديد تفاعل جديد بين NST وإنزيم غليكوزيل مرتبط وظيفيا9.
ويستخدم أحدث تعديل لفحص تكملة لوسيفيراز المنقسمة، NanoBiT، في البروتوكول المعروض هنا15. وهو يعتمد على إعادة تكوين إنزيم لوسيفيراز (على سبيل المثال ، نانولوك) من الشظيتين – الجزء الكبير ، الذي يطلق عليه اسم BiT أو LgBiT الكبير ، وهو بروتين 17.6 kDa ، والصغير ، الذي يتكون من 11 حمضا أمينيا فقط ، يطلق عليه اسم BiT الصغير أو SmBiT. يتم دمج البروتينين المهمين مع الشظايا التكميلية ويتم التعبير عنهما بشكل عابر في خط خلية بشرية. إذا تفاعل البروتينان الانصهاري ، يتم إنتاج لمعان في الموقع عند إضافة ركيزة نفاذة للخلية. تم تحسين هذين الشظيتين بحيث يرتبطان بالحد الأدنى من التقارب ما لم يتم جمعهما معا من خلال التفاعل بين البروتينات ذات الأهمية التي يتم دمجها فيها.
بشكل عام ، تتمتع الطرق القائمة على التلألؤ الحيوي ببعض المزايا على الطرق القائمة على التألق. تحتوي إشارات اللمعان الحيوي على نسبة إشارة إلى ضوضاء أعلى لأن لمعان الخلفية لا يكاد يذكر مقارنة بالإشارة المشتقة من luciferase16. في المقابل ، عادة ما تعاني النهج القائمة على التألق من خلفية عالية نسبيا ناجمة عن ظاهرة التألق الذاتي. إلى جانب ذلك ، فإن التلألؤ الحيوي أقل ضررا على الخلايا التي تم تحليلها من التألق ، كما هو الحال في الحالة الأولى ليست هناك حاجة لإثارة العينة. لهذه الأسباب ، تتفوق مناهج اللمعان الحيوي لدراسة PPIs في الجسم الحي على طرق الفلورسنت الشائعة الاستخدام مثل Förster Resonance Energy Transfer (FRET) أو Molecular Fluorescence Complementation (BiFC).
يعتمد بروتوكولنا على إحالة التلألؤ الذي تم الحصول عليه لمزيج البروتين ذي الأهمية إلى التلألؤ الذي تم الحصول عليه لمجموعة التحكم. ويشمل هذا الأخير أحد البروتينات التي تم اختبارها والتي يتم دمجها مع جزء أكبر وبروتين تحكم (على سبيل المثال ، HaloTag) ، يندمج مع جزء أصغر. هذا الأخير هو بروتين من أصل بكتيري لا يتوقع أن يتفاعل مع أي من بروتينات الثدييات. استخدام هذا البروتين كعنصر تحكم يضع قيودا على طوبولوجيا أزواج البروتينات المقيمة في غولجي المراد تحليلها. نظرا لأنه في خلايا الثدييات يتم تصنيع هذا البروتين في السيتوبلازم ، يجب أن يكون لكل من البروتينين محل الاهتمام ذيل سيتوبلازمي واحد على الأقل.
ويمكن أن يكون هذا النهج مفيدا بشكل خاص للفحص الأولي لمؤشرات أسعار المنتجين. قد تصبح الطريقة المفضلة عندما يتم التعبير عن بروتينات الاندماج ذات الأهمية عند مستويات غير كافية ببساطة لتطبيق نهج أخرى. وبالمثل ، يمكن أن يكون اختبار تكملة luciferase المجزأة هو الخيار الأفضل إذا تم التعبير عن البروتينات ذات الأهمية بمستويات عالية ، ولكن هذا يؤثر سلبا على توطينها تحت الخلوي أو من المعروف أنه يفرض تفاعلات غير محددة. نظرا لأن الجزء الأصغر يحتوي على 11 حمضا أمينيا فقط ، يمكن تطبيق اختبار تكملة luciferase المنقسم عند استخدام علامات أكبر أمر مستحيل. وأخيرا، يمكن استخدامه لزيادة تأكيد البيانات التي تم الحصول عليها باستخدام تقنيات أخرى، كما هو الحال في الحالة المعروضة هنا.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا نقدم بروتوكولا مفصلا يتيح عرض المجمعات غير المتجانسة التي تشكلت بين بروتينات الغشاء من النوع الثالث المقيمة في غولجي ، مثل NSTs ، باستخدام فحص تكملة luciferase المنقسمة. يتضمن النهج المقترح لتحليل البيانات وتفسيرها ربط التلألؤ الذي تم الحصول عليه لمزيج البروتين ذي الأهمية بالتلألؤ الذي تم ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من خلال المنحة رقم 2016/23/D/NZ3/01314 من المركز الوطني للعلوم (NCN) ، كراكوف ، بولندا.
Materials
| 0.25% trypsin-EDTA solution | |||
| Adherent mammalian cell line | |||
| BioCoat Poly-D-Lysine 96-well White/Clear Flat Bottom TC-treated Microplate, with Lid | Corning | 356651 | |
| Cell culture centrifuge | |||
| Cell culture supplements (heat-inactivated fetal bovine serum, L-glutamine, penicillin, streptamycin) | |||
| CO2 incubator | |||
| Expression plasmids encoding protein(s) of interest not tagged with NanoBiT fragments | |||
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
| GloMax Discover Microplate Reader (or a different luminescence microplate reader) | Promega | GM3000 | |
| Growth medium dedicated to the cell line used | |||
| Materials and reagents for standard molecular cloning (bacteria, thermostable polymerase, restriction enzymes, DNA ligase, materials and reagents for nucleic acid purification) | |||
| NanoBiT MCS Starter System | Promega | N2014 | This kit contains vectors enabling tagging of the proteins of interest with NanoBiT fragments at different orientations as well as the control plasmid encoding HaloTag protein fused with SmBiT and a positive control plasmid pair. |
| Nano-Glo Live Cell Assay System | Promega | N2011 | This kit contains furimazine, which is a substrate enabling detection of the NanoLuc activity in living cells, and a dedicated dilution buffer. |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium, no phenol red | Gibco | 11058021 | |
| Oribital shaker | |||
| Software for data analysis (e.g. GraphPad Prism) | |||
| Thermocycler |
References
- Hadley, B., et al. Structure and function of nucleotide sugar transporters: Current progress. Computational and Structural Biotechnology Journal. 10 (16), 23-32 (2014).
- Puglielli, L., Hirschberg, C. B. Reconstitution, identification, and purification of the rat liver Golgi membrane GDP-fucose transporter. Journal of Biological Chemistry. 274 (50), 35596-35600 (1999).
- Puglielli, L., Mandon, E. C., Rancour, D. M., Menon, A. K., Hirschberg, C. B. Identification and purification of the rat liver Golgi membrane UDP-N-acetylgalactosamine transporter. Journal of Biological Chemistry. 274 (7), 4474-4479 (1999).
- Gao, X., Dean, N. Distinct protein domains of the yeast Golgi GDP-mannose transporter mediate oligomer assembly and export from the endoplasmic reticulum. Journal of Biological Chemistry. 275 (23), 17718-17727 (2000).
- Olczak, M., Guillen, E. Characterization of a mutation and an alternative splicing of UDP-galactose transporter in MDCK-RCAr cell line. Biochimica et Biophysica Acta. 1763 (1), 82-92 (2006).
- Maszczak-Seneczko, D., Sosicka, P., Majkowski, M., Olczak, T., Olczak, M. UDP-N-acetylglucosamine transporter and UDP-galactose transporter form heterologous complexes in the Golgi membrane. FEBS Letters. 586 (23), 4082-4087 (2012).
- Nji, E., Gulati, A., Qureshi, A. A., Coincon, M., Drew, D. Structural basis for the delivery of activated sialic acid into Golgi for sialyation. Nature Structural and Molecular Biology. 26 (6), 415-423 (2019).
- Parker, J. L., Corey, R. A., Stansfeld, P. J., Newstead, S. Structural basis for substrate specificity and regulation of nucleotide sugar transporters in the lipid bilayer. Nature Communications. 10 (1), 4657 (2019).
- Wiertelak, W., Sosicka, P., Olczak, M., Maszczak-Seneczko, D. Analysis of homologous and heterologous interactions between UDP-galactose transporter and beta-1,4-galactosyltransferase 1 using NanoBiT. Analytical Biochemistry. 593, 113599 (2020).
- Hong, K., Ma, D., Beverley, S. M., Turco, S. J. The Leishmania GDP-mannose transporter is an autonomous, multi-specific, hexameric complex of LPG2 subunits. 생화학. 39 (8), 2013-2022 (2000).
- Sosicka, P., et al. An insight into the orphan nucleotide sugar transporter SLC35A4. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1864 (5), 825-838 (2017).
- Sprong, H., et al. Association of the Golgi UDP-galactose transporter with UDP-galactose:ceramide galactosyltransferase allows UDP-galactose import in the endoplasmic reticulum. Molecular Biology of the Cell. 14 (8), 3482-3493 (2003).
- Maszczak-Seneczko, D., et al. UDP-galactose (SLC35A2) and UDP-N-acetylglucosamine (SLC35A3) Transporters Form Glycosylation-related Complexes with Mannoside Acetylglucosaminyltransferases (Mgats). Journal of Biological Chemistry. 290 (25), 15475-15486 (2015).
- Khoder-Agha, F., et al. N-acetylglucosaminyltransferases and nucleotide sugar transporters form multi-enzyme-multi-transporter assemblies in golgi membranes in vivo. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (9), 1821-1832 (2019).
- Dixon, A. S., et al. NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells. ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).
- Tung, J. K., Berglund, K., Gutekunst, C. -. A., Hochgeschwender, U., Gross, R. E. Bioluminescence imaging in live cells and animals. Neurophotonics. 3 (2), 025001 (2016).
- Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Molecular Cell. 9 (4), 789-798 (2002).
- Inoue, A., et al. Illuminating G-Protein-Coupling Selectivity of GPCRs. Cell. 177 (7), 1933-1947 (2019).
- White, C. W., Caspar, B., Vanyai, H. K., Pfleger, K. D. G., Hill, S. J. CRISPR-Mediated Protein Tagging with Nanoluciferase to Investigate Native Chemokine Receptor Function and Conformational Changes. Cell Chemical Biology. 27, 499-510 (2020).
- Akinjiyan, F. A., et al. A Novel Luminescence-Based High-Throuput Approach for Cellular Resolution of Protein Ubiquitination using Tandem Ubiquitin Binding Entities (TUBEs). SLAS Discovery. 25 (4), 350-360 (2020).
- Soave, M., Kellam, B., Woolard, J., Briddson, S. J., Hill, S. J. NanoBiT Complemetation to Monitor Agonist-Induced Adenosine A1 Receptor Internalization. SLAS Discovery. 25 (2), 186-194 (2020).
- Crowley, E., Leung, E., Reynisson, J., Richardson, A. Rapid changes in the ATG5-ATG16L1 complex following nutrient deprivation measured using NanoLuc Binary Technlology (NanoBiT). FEBS Journal. , 15275 (2020).
- Shetty, S. K., Walzem, R. L., Davies, B. S. J. A novel NanoBiT-based assay monitors the interaction between lipoprotein lipase and GPIHBP1 in real time. Journal of Lipid Research. 61 (4), 546-559 (2020).
