스플릿 루시퍼라아제 보체 분석을 사용하여 골지-레지던트 타입 III 막 단백질에 의해 형성된 이종 복합체의 시연
Summary
여기에 제시된 프로토콜은 분할 루시퍼라제 보체 분석의 가장 최근의 변이체를 사용하여 살아있는 포유동물 세포에서 세포질적으로 노출된 N- 및/또는 C-테르미니와 골지-상주 III형 막 단백질 사이의 이종 상호작용의 발생을 입증하기 위한 것이다.
Abstract
이 프로토콜의 목표는 뉴클레오티드 당 수송체 (NSTs)에 의해 형성된 이종 복합체를 입증하기 위한 분할 루시퍼라제 상보의 가장 최근의 변이체의 적용 가능성을 탐구하는 것이다. 이러한 ER- 및 골지-상주 다막횡단 단백질은 세포질적으로 합성된 뉴클레오티드 당을 소기관막을 가로질러 운반하여 그들의 기질과 함께 글리코실화를 매개하는 효소를 공급한다. NST는 이량체 및/또는 그 이상의 올리고머로서 존재한다. 서로 다른 NST 간의 이종 상호 작용도보고되었습니다. 이 기술이 NST 이량체화 현상을 연구하는 데 적합한지 여부를 확인하기 위해, 우리는 이전에 여러 가지 다른 방법으로 연관되는 것으로 밝혀진 두 골지 거주 NST의 조합에 대해 테스트했습니다. 루시퍼라아제 보체 분석은 높은 발현 수준을 요구하지 않기 때문에 골지-상주막 단백질 간의 상호작용을 연구하는 데 특히 적합한 것으로 보이며, 이는 종종 단백질 오국소화를 유발하고 위양성의 위험을 증가시킨다.
Introduction
이 원고는 분할 루시퍼라제 보체 분석의 가장 최근의 변이체를 사용하여 일시적으로 형질감염된 인간 세포에서 골지-레지던트 타입 III 막 단백질 사이의 이종 상호작용의 존재를 확인하기 위한 단계별 프로토콜을 기술한다. 이 절차는 뉴클레오티드 당 수송체 (NSTs)에 대해 가장 광범위하게 테스트되었지만 N- 및 / 또는 C- 테르미니가 세포질에 직면하고있는 다른 골지 상주 유형 III 막 단백질에 대해서도 긍정적 인 결과를 얻을 수있었습니다.
우리의 연구 그룹은 거대 분자의 글리코실화에서 NST의 역할을 탐구합니다. NSTs는 골지- 및/또는 ER-상주형 III 막 단백질이며, N- 및 C-테르미니는 오르가넬라 막의 세포질 측에 직면한다1. NST는 뉴클레오티드 활성화 당을 소기관막을 가로질러 운반하여 글리코실트랜스퍼라제를 기질과 함께 공급하는 것으로 생각된다. NST는 이량체 및/또는 그 이상의 올리고머2,3,4,5,6,7,8,9,10을 형성한다. 더욱이, 상이한 NST들 사이의 이종성 상호작용도 또한 보고되었다6,11. NSTs는 또한 기능적으로 관련된 글리코실화 효소12,13,14와 복합체를 형성하는 것으로 입증되었다. 우리는 NST와 기능적으로 관련된 골지 상주 단백질의 상호 작용을 연구하기 위해 현재 사용되는 기술인 형광 수명 이미징 (FLIM) 기반 FRET 접근법에 대한 대안을 모색하여 분할 루시퍼라제 보완 분석을 테스트하기로 결정했습니다. 이를 통해 NST와 기능적으로 관련된 글리코실화 효소9 사이의 새로운 상호작용을 확인할 수 있었습니다.
분할 루시퍼라제 보체 분석의 가장 최근의 변형, NanoBiT가 여기에 제시된 프로토콜15에 사용된다. 그것은 두 단편으로부터 루시퍼라제 효소 (예를 들어, NanoLuc)의 재구성에 의존합니다 – 큰 BiT 또는 LgBiT로 불리는 큰 단백질, 17.6 kDa 단백질, 그리고 작은 BiT 또는 SmBiT로 불리는 11 개의 아미노산으로 구성된 작은 단백질. 관심있는 두 단백질은 상보적 단편과 융합되고 인간 세포주에서 일시적으로 발현된다. 두 융합 단백질이 상호작용하는 경우, 세포 투과성 기질의 첨가시 계내에서 발광이 생성된다. 이 두 단편은 그들이 융합된 관심있는 단백질 사이의 상호작용에 의해 함께 모이지 않는 한 최소 친화력과 연관되도록 최적화되었다.
일반적으로, 생체발광-기반 방법은 형광에 기초한 것들보다 몇 가지 장점이 있다. 생체 발광 신호는 루시페라아제 유래 신호16에 비해 배경 발광이 무시할 수 있기 때문에 더 높은 신호 대 잡음비를 갖는다. 대조적으로, 형광-기반 접근법은 일반적으로 자가형광의 현상에 의해 야기되는 비교적 높은 배경으로부터 고통받는다. 게다가, 생체 발광은 형광보다 분석 된 세포에 덜 해롭고, 전자의 경우와 마찬가지로 샘플을 여기시킬 필요가 없습니다. 이러한 이유로 생체 내에서 PPI를 연구하는 생체 발광 접근법은 Förster 공명 에너지 전달 (FRET) 또는 Bi분자 형광 보체 (BiFC)와 같이 일반적으로 사용되는 형광 방법보다 우수합니다.
우리의 프로토콜은 관심있는 단백질 조합에 대해 얻어진 발광을 대조군 조합에 대해 수득된 발광에 대해 언급하는 것에 의존한다. 후자는 더 큰 단편 및 대조군 단백질 (예를 들어, HaloTag)과 융합되고, 더 작은 단편과 융합되는 시험된 단백질 중 하나를 포함한다. 후자는 포유류 단백질과 상호 작용할 것으로 기대되지 않는 박테리아 기원의 단백질입니다. 이 단백질을 대조군으로 사용하는 것은 분석하고자 하는 단백질의 골지-상주 쌍의 토폴로지에 한계를 제기한다. 포유동물 세포에서 이 단백질은 세포질에서 합성되기 때문에, 관심있는 두 단백질 모두 적어도 하나의 세포질 꼬리를 가져야 한다.
이러한 접근법은 PPI의 초기 스크리닝에 특히 유용할 수 있다. 관심있는 융합 단백질이 단순히 다른 접근법이 적용되기에 불충분 한 수준으로 발현 될 때 선택되는 방법이 될 수 있습니다. 유사하게, 분할 루시퍼라제 보체 분석은 관심있는 단백질이 높은 수준으로 발현되는 경우에 최선의 선택이 될 수 있지만, 이것은 그들의 아세포 국소화에 악영향을 미치거나 비특이적 상호작용을 강제하는 것으로 알려져 있다. 더 작은 단편은 단지 11개의 아미노산만을 갖기 때문에, 분할 루시퍼라제 상보화 분석은 더 큰 태그를 사용할 때 적용될 수 있는 것은 불가능하다. 마지막으로, 여기에 제시된 경우와 같이 다른 기술을 사용하여 획득한 데이터를 추가로 확인하기 위해 사용될 수 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기서 우리는 분할 루시퍼라제 보체 검정을 사용하여 NSTs와 같은 골지-상주 유형 III 막 단백질 사이에 형성된 이종 복합체의 시연을 가능하게 하는 상세한 프로토콜을 제공한다. 데이터 분석 및 해석에 대한 제안된 접근법은 관심있는 단백질 조합에 대해 수득된 발광을 상응하는 대조 조합에 대해 수득된 발광과 관련시키는 것을 포함하며, 이는 더 작은 단편과 융합된 박테리아 기원의 더 큰 단?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 폴란드 크라쿠프의 국립 과학 센터 (NCN)의 보조금 번호 2016 / 23 / D / NZ3 / 01314에 의해 지원되었습니다.
Materials
| 0.25% trypsin-EDTA solution | |||
| Adherent mammalian cell line | |||
| BioCoat Poly-D-Lysine 96-well White/Clear Flat Bottom TC-treated Microplate, with Lid | Corning | 356651 | |
| Cell culture centrifuge | |||
| Cell culture supplements (heat-inactivated fetal bovine serum, L-glutamine, penicillin, streptamycin) | |||
| CO2 incubator | |||
| Expression plasmids encoding protein(s) of interest not tagged with NanoBiT fragments | |||
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
| GloMax Discover Microplate Reader (or a different luminescence microplate reader) | Promega | GM3000 | |
| Growth medium dedicated to the cell line used | |||
| Materials and reagents for standard molecular cloning (bacteria, thermostable polymerase, restriction enzymes, DNA ligase, materials and reagents for nucleic acid purification) | |||
| NanoBiT MCS Starter System | Promega | N2014 | This kit contains vectors enabling tagging of the proteins of interest with NanoBiT fragments at different orientations as well as the control plasmid encoding HaloTag protein fused with SmBiT and a positive control plasmid pair. |
| Nano-Glo Live Cell Assay System | Promega | N2011 | This kit contains furimazine, which is a substrate enabling detection of the NanoLuc activity in living cells, and a dedicated dilution buffer. |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium, no phenol red | Gibco | 11058021 | |
| Oribital shaker | |||
| Software for data analysis (e.g. GraphPad Prism) | |||
| Thermocycler |
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