Demonstração de Complexos Heterologos formados por Proteínas de Membrana Tipo III de Golgi-Residente usando Ensaio de Complementação de Luciferase Dividida
Summary
O protocolo aqui apresentado destina-se a demonstrar a ocorrência de interações heterólogas entre proteínas de membrana tipo III residente em Golgi com n- e/ou C-termini expostos citoplasma em células de mamíferos vivos usando a variante mais recente do ensaio de complementação da luciferase dividida.
Abstract
O objetivo deste protocolo é explorar a aplicabilidade da variante mais recente da complementação da luciferase dividida para demonstrar complexos heterologos formados por transportadores de açúcar nucleotídeos (NSTs). Essas proteínas multitransmembrana residentes em ER e Golgi carregam os açúcares nucleotídeos citoplasmicamente sintetizados através de membranas organelas para fornecer enzimas que mediam a glicosiloção com seus substratos. Os NSTs existem como dimers e/ou oligômeros superiores. Interações heterólogas entre diferentes NSTs também foram relatadas. Para verificar se a técnica é adequada para estudar o fenômeno da heteromerização do NST, testamos-a contra uma combinação dos dois NSTs residentes em Golgi que foram previamente mostrados para associar por vários outros meios. O ensaio de complementação da luciferase parece ser particularmente adequado para estudar interações entre proteínas de membrana residente em Golgi, pois não requer altos níveis de expressão, que muitas vezes desencadeiam a deslocalização da proteína e aumentam o risco de falsos positivos.
Introduction
Este manuscrito descreve um protocolo passo-a-passo para verificar a presença de interações heterólogas entre proteínas de membrana tipo III residentes em Golgi em células humanas transitóriamente transfectadas usando a variante mais recente do ensaio de complementação da luciferase dividida. O procedimento foi mais extensivamente testado contra transportadores de açúcar nucleotídeos (NSTs), mas também conseguimos resultados positivos para outras proteínas de membrana tipo III residentes em Golgi cujas proteínas de membrana N e/ou C-termini estão enfrentando o citoplasma.
Nosso grupo de pesquisa explora o papel dos NSTs na glicosilação de macromoléculas. Os NSTs são proteínas de membrana tipo III residentes em Golgi e/ou ER com n-e C-termini voltados para o lado citoplasmásmico da membrana organellar1. Acredita-se que os NSTs carreguem açúcares ativados por nucleotídeos através de membranas organela para fornecer glicosilatransferases com seus substratos. Os NSTs formam dimers e/ou maiores oligômeros2,3,4,5,6,7,8,9,10. Além disso, também foram relatadas interações heterólogas entre diferentes NSTs. Os NSTs também foram demonstrados para formar complexos com enzimas de glicosilação funcionalmente relacionadas12,13,14. Buscamos uma alternativa à técnica atualmente utilizada, a abordagem FRET baseada em fluorescência (FLIM), para estudar interações de NSTs e proteínas residentes em Golgi, então decidimos testar o ensaio de complementação da luciferase dividida. Permitiu identificar uma nova interação entre um NST e uma enzima de glicosylation funcionalmente relacionada9.
A modificação mais recente do ensaio de complementação da luciferase split, NanoBiT, é utilizada no protocolo aqui apresentado. Ela se baseia na reconstituição da enzima luciferase (por exemplo, NanoLuc) dos dois fragmentos – o grande, denominado como BiT grande ou LgBiT, uma proteína de 17,6 kDa, e o pequeno, composto por apenas 11 aminoácidos, denominados como pequenos BiT ou SmBiT. As duas proteínas de interesse são fundidas com os fragmentos complementares e transitavelmente expressas em uma linha celular humana. Se as duas proteínas de fusão interagirem, uma luminescência é produzida in situ após a adição de um substrato permeável celular. Esses dois fragmentos foram otimizados para que se associem à afinidade mínima, a menos que sejam reunidos por uma interação entre as proteínas de interesse a que se fundem.
Em geral, os métodos baseados em bioluminescência têm algumas vantagens sobre os baseados na fluorescência. Os sinais bioluminescentes têm uma maior relação sinal-ruído porque a luminescência de fundo é insignificante em comparação com o sinal derivado da luciferase16. Em contraste, abordagens baseadas em fluorescência geralmente sofrem de um fundo relativamente alto causado pelo fenômeno da autofluorescência. Além disso, a bioluminescência é menos prejudicial às células analisadas do que a fluorescência, pois no primeiro caso não há necessidade de excitar a amostra. Por essas razões, abordagens bioluminescentes para estudar PPIs in vivo superam os métodos fluorescentes comumente usados como Förster Resonance Energy Transfer (FRET) ou Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC).
Nosso protocolo se baseia em referir a luminescência obtida para a combinação proteica de interesse à luminescência obtida para a combinação de controle. Esta última inclui uma das proteínas testadas que é fundida com um fragmento maior e uma proteína de controle (por exemplo, HaloTag), fundida com um fragmento menor. Esta última é uma proteína de origem bacteriana que não se espera que interaja com nenhuma das proteínas mamíferas. O uso dessa proteína como controle coloca limitações à topologia dos pares de proteínas residentes em Golgi a serem analisados. Uma vez que nas células de mamíferos essa proteína é sintetizada no citoplasma, ambas as proteínas de interesse devem ter pelo menos uma cauda citoplasmática.
Esta abordagem pode ser particularmente útil para a triagem inicial de PPIs. Pode se tornar o método de escolha quando as proteínas de fusão de interesse são expressas em níveis que são simplesmente insuficientes para que outras abordagens sejam aplicadas. Da mesma forma, o ensaio de complementação da luciferase dividido pode ser a melhor opção se as proteínas de interesse forem expressas em níveis elevados, mas isso afeta negativamente sua localização subcelular ou é conhecido por forçar interações não específicas. Como o fragmento menor tem apenas 11 aminoácidos, o ensaio de complementação da luciferase dividido pode ser aplicado ao usar tags maiores é impossível. Por fim, pode ser empregado para confirmar ainda mais os dados obtidos utilizando outras técnicas, como no caso aqui apresentado.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui fornecemos um protocolo detalhado que permite a demonstração de complexos heterologos formados entre proteínas de membrana tipo III residente em Golgi, como NSTs, utilizando o ensaio de complementação da luciferase split. A abordagem proposta para análise e interpretação de dados envolve relacionar a luminescência obtida para a combinação proteica de interesse à luminescência obtida para a combinação de controle correspondente, que é composta por uma das proteínas de interesse fundidas com o fragmen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela concessão nº 2016/23/D/NZ3/01314 do Centro Nacional de Ciência (NCN), Cracóvia, Polônia.
Materials
| 0.25% trypsin-EDTA solution | |||
| Adherent mammalian cell line | |||
| BioCoat Poly-D-Lysine 96-well White/Clear Flat Bottom TC-treated Microplate, with Lid | Corning | 356651 | |
| Cell culture centrifuge | |||
| Cell culture supplements (heat-inactivated fetal bovine serum, L-glutamine, penicillin, streptamycin) | |||
| CO2 incubator | |||
| Expression plasmids encoding protein(s) of interest not tagged with NanoBiT fragments | |||
| FuGENE HD Transfection Reagent | Promega | E2311 | |
| GloMax Discover Microplate Reader (or a different luminescence microplate reader) | Promega | GM3000 | |
| Growth medium dedicated to the cell line used | |||
| Materials and reagents for standard molecular cloning (bacteria, thermostable polymerase, restriction enzymes, DNA ligase, materials and reagents for nucleic acid purification) | |||
| NanoBiT MCS Starter System | Promega | N2014 | This kit contains vectors enabling tagging of the proteins of interest with NanoBiT fragments at different orientations as well as the control plasmid encoding HaloTag protein fused with SmBiT and a positive control plasmid pair. |
| Nano-Glo Live Cell Assay System | Promega | N2011 | This kit contains furimazine, which is a substrate enabling detection of the NanoLuc activity in living cells, and a dedicated dilution buffer. |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium, no phenol red | Gibco | 11058021 | |
| Oribital shaker | |||
| Software for data analysis (e.g. GraphPad Prism) | |||
| Thermocycler |
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