Aislamiento e identificación comensal conjuntival en ratones
Summary
Aquí se presenta un protocolo para el aislamiento y la amplificación de las bacterias conjuntivales anaerobias aeróbicas y facultativas del ratón usando una hisopo ocular única y un paso de enriquecimiento basado en la cultura con la identificación posterior por métodos basados microbiológicos y espectrometría de masas MALDI-TOF.
Abstract
La superficie ocular era considerada una vez inmune privilegiada y abiótica, pero aparece recientemente que hay una presencia commensal pequeña, pero persistente. La identificación y la supervisión de las especies bacterianas en la mucosa ocular han sido desafiadoras debido a su abundancia baja y a la disponibilidad limitada de la metodología apropiada para el crecimiento y la identificación comensales. Hay dos enfoques estándar: métodos basados en el cultivo o métodos de secuenciación de ADN. El primer método es problemático debido a las bacterias recuperables limitadas y el segundo acercamiento identifica las bacterias vivas y muertas que llevan a una representación aberrante del espacio ocular. Desarrollamos un método robusto y sensible para el aislamiento bacteriano mediante el desarrollo de técnicas de cultivo microbiológico estándar. Esta es una técnica basada en hisopos, utilizando un hisopo delgado hecho “en el laboratorio” que se dirige a la conjuntiva inferior, seguido de un paso de amplificación para los géneros anaeróbicos aeróbicos y facultativos. Este protocolo nos ha permitido aislar e identificar especies conjuntivales como Corynebacterium spp., Coagulase Negative Staphylococcus spp., Streptococcus spp.,etc. El enfoque es adecuado para definir la diversidad commensal en ratones bajo diferentes condiciones de enfermedad.
Introduction
El objetivo de este protocolo es aumentar el aislamiento específico de microbios anaeróbicos aeróbicos y facultativos viables y raros de la conjuntiva ocular para caracterizar el microbioma ocular. Amplios estudios han perfilado comunidades de la mucosa conmensal en la piel, intestino, vías respiratorias y genitales y muestran que estas comunidades influyen en el desarrollo del sistema inmune y la respuesta1,2,3. Se ha demostrado que las comunidades comensales oculares cambian durante ciertas patologías de la enfermedad, como la enfermedad del ojo seco4,el síndrome de Sjogren5 y la diabetes6. Sin embargo, la capacidad de definir una comunidad comensal de superficie ocular típica se ve obstaculizada por su abundancia relativamente baja en comparación con los otros sitios de la mucosa6,7,8. Esto provoca una controversia sobre si existe un microbioma ocular residente y si existe, si difiere del microbioma de la piel y, en consecuencia, su efecto local sobre el desarrollo y la respuesta del sistema inmune innato. Este protocolo puede ayudar a resolver esta pregunta.
En general, los enfoques para definir el nicho comensal ocular se basan en técnicas de secuenciación y cultivo4,7,9. La secuenciación del ADNr 16 S y el análisis BRISK7 muestran una diversidad más amplia que las técnicas basadas en la cultura, pero son incapaces de diferenciar entre microbios vivos y muertos. Dado que la superficie ocular es hostil a muchos microbios debido a las propiedades antimicrobianas de la película lagrimal4 que generan una gran variedad de fragmentos de ADN, los enfoques basados en adn detectarán estos artefactos que pueden sesgar los datos hacia la identificación de bacterias muertas como comensales residentes en lugar de contaminantes. Esto resulta en una aberrante identificación comensal y caracterización del espacio ocular como mayor en abundancia y diversidad de microbios10. Esto hace que sea difícil definir el microbioma ocular residente a través de métodos basados en el ADN. Mientras que, las técnicas estándar basadas en el cultivo no pueden detectar los contraensales porque la carga es demasiado baja11. Nuestro método mejora las prácticas estándar mediante el uso de un hisopo delgado que puede dirigirse a la conjuntiva, evitando así la contaminación de la piel vecina, así como el concepto de que los organismos viables pueden enriquecerse mediante un breve cultivo en medios densos en nutrientes con el objetivo de resucitar viables pero no cultivables, así como, enriquecer para microbios viables raros.
Los resultados, abundancia relativa de comensales oculares por hisopo ocular, caracterizan el microbioma residente de la conjuntiva y son importantes para fines comparativos. Nuestros datos muestran que hay una diferencia entre la piel y la microbiota conjuntival, así como una mayor diversidad con el aumento de la edad y una diferencia específica del sexo en la abundancia. Además, este enfoque ha encontrado de forma reproducible diferencias cómicas en ratones knock-out12. Este protocolo se puede aplicar para describir el microbioma ocular que puede variar debido a las prácticas de enjaulado, la geografía o el estado de la enfermedad, así como los efectos locales de los metabolitos y productos consal sobre el desarrollo y la respuesta del sistema inmunológico.
Protocol
Representative Results
Discussion
Debido al estado paucibacteriano de la superficie ocular, muchos laboratorios han tenido dificultades para aislar los comensales oculares7,20,resultando en un bajo número de muestras con crecimiento, baja abundancia y baja diversidad8. Este método mejora significativamente las prácticas de cultivo estándar4,21 mediante la adición de un paso de enriquecimiento, así como un his…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El financiamiento de P30 DK034854 apoyó VY, LB y estudios en el Massachusetts Host-Microbiome Center y el financiamiento de NIH / NEI R01 EY022054 apoyó MG.
Materials
| 0.1 to 10 µl pipet tip | USA Scientific | 1110-300 | autoclave before use |
| 0.5 to 10 µl Eppendorf pipet | Fisher Scientific | 13-690-026 | |
| 1 ml syringe | Fisher Scientific | BD309623 | 1 syringe for each eye swab group |
| 1.5 ml Eppendorf tubes | USA Scientific | 1615-5500 | autoclave before use |
| 1000 µ ml pipet tip | USA Scientific | 1111-2021 | autoclave before use |
| 200 to 1000µl Gilson pipetman (P1000) | Fisher Scientific | F123602G | |
| 25 G needle | Fisher Scientific | 14-826AA | 1 needle per eye swab group |
| 3 % Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | S25359 | |
| 37 ° C Incubator | Lab equipment | ||
| 70 % Isopropanol | Fisher Scientific | PX1840-4 | |
| Ana-Sed Injection (Xylazine 100 mg/ml) | Santa Cruz Animal Health | SC-362949Rx | |
| BD BBL Gram Stain kit | Fisher Scientific | B12539 | |
| Bunsen Burner | Lab equipment | ||
| Clean paper towels | Lab equipment | ||
| Cotton Batting/Sterile rolled cotton | CVS | ||
| Disposable 1 ml Pipets | Fisher Scientific | 13-711-9AM | for Gram stain and catalase tests |
| E.coli | ATTC | ATCC 8739 | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | for Gram stain and catalase tests |
| Ketamine (100mg/ml) | Henry Schein | 9950001 | |
| Mac Conkey Agar Plates | Fisher Scientific | 4321270 | store at 4 °C until ready to use |
| Mannitol Salt Agar | Carolina Biological Supply | 784641 | Prepare plates according to mfr's instructions, store at 4 °C for 1 week |
| Mice | Jackson Labs | C57/BL6J | |
| Petri Dishes | Fisher Scientific | 08-757-12 | for Mannitol Salt agar plates |
| RPI Brain Heart Infusion Media | Fisher Scientific | 50-488525 | prepare according to directions and autoclave |
| SteriFlip (0.22 µm pore size polyester sulfone) | EMD/Millipore, Fisher Scientifc | SCGP00525 | to sterilize anesthesia |
| Sterile Corning Centrifuge Tube | Fisher Scientific | 430829 | anesthesia preparation |
| Sterile mouse cage | Lab equipment | ||
| Tooth picks (round bamboo) | Kitchen Essentials | autoclave before use and swab preparation | |
| Trypticase Soy Agar II with 5% Sheep's Blood Plates | Fisher Scientific | 4321261 | store at 4 °C until ready to use |
| Vitek target slide | BioMerieux Inc. Durham,NC | ||
| Vitek-MS | BioMerieux Inc. Durham,NC | ||
| Vitek-MS CHCA matrix solution | BioMerieux Inc. Durham, NC | 411071 | |
| Single use eye drops | CVS Pharmacy | Bausch and Lomb Soothe Lubricant Eye Drops, 28 vials, 0.02 fl oz. each |
References
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