Denne protokollen tar sikte på å transplantere en 3D bioprinted patch på epicardium av infarcted mus modellering hjertesvikt. Det inkluderer detaljer om anestesi, kirurgisk bryståpning, permanent ligation av venstre fremre synkende (LAD) koronararterie og anvendelse av en bioprinted patch på det infarcted området av hjertet.
Testing av regenerative egenskaper av 3D bioprinted hjertepatcher in vivo ved hjelp av murine modeller av hjertesvikt via permanent venstre fremre synkende (LAD) ligation er en utfordrende prosedyre og har en høy dødelighet på grunn av sin natur. Vi utviklet en metode for konsekvent å transplantere bioprinted patcher av celler og hydrogeler på epicardium av en infarcted mus hjerte for å teste sine regenerative egenskaper på en robust og gjennomførbar måte. Først blir en dypt bedøvet mus forsiktig intubert og ventilert. Etter venstre lateral thoracotomi (kirurgisk åpning av brystet), er den eksponerte LAD permanent ligated og bioprinted patch transplantert på epicardium. Musen gjenoppretter raskt fra prosedyren etter brystlukking. Fordelene med denne robuste og raske tilnærmingen inkluderer en spådd 28-dagers dødelighet på opptil 30% (lavere enn de 44% rapportert av andre studier ved hjelp av en lignende modell for permanent LAD ligation hos mus). Videre er tilnærmingen beskrevet i denne protokollen allsidig og kan tilpasses for å teste bioprinted patcher ved hjelp av forskjellige celletyper eller hydrogeler der høyt antall dyr er nødvendig for å optimalt kraftstudier. Samlet sett presenterer vi dette som en fordelaktig tilnærming som kan endre preklinisk testing i fremtidige studier for feltet hjerteregenerering og vevsteknikk.
En hjertetransplantasjon er gullstandardbehandling for pasienter med hjertesvikt i sluttfasen, men det er mangel på donororganer. Det krever immunsystem undertrykkelse for å hindre graft avvisning og ett års dødelighet er 15% over hele verden1. Derfor er det et langvarig incitament til å regenerere myokardiet i prekliniske dyremodeller med sikte på å oversette til menneskeligeforsøk 2,3,4,5,6,7,8,9. Nylige fremskritt i 3D bioprinting av stamceller eller stamcelleavledede hjerteceller har fått oppmerksomhet som en lovende tilnærming til å regenerere myokardiet2,,3,,9,,10,,11,,12.
De første menneskelige sikkerhetsforsøkene som bruker patcher for å regenerere hjertet er rapportert, med autologe benmargmonukleære celler suspendert i kollagen eller embryonale stamcelleavledede hjertetamtamceller i fibrin, transplantert til epicardium7,8,13. Men for en mer presis, skalerbar, automatisk og reproduserbar metode, er 3D-bioprinting av optimaliserte hydrogelpatcher som skal brukes på hjertets epiardiale overflate en lovende tilnærming for å regenerere myokardiet for pasienter som ellers ville trengeen hjertetransplantasjon 2,10,11,12.
Før oversettelse til menneskelige studier kan oppstå, er det nødvendig med prekliniske dyrestudier. Prekliniske in vivo modeller som forfølger regenerering av myokardiet er rapportert hosgriser 5,sauer 14,rotter6 og mus4. En vanlig modell av hjerteinfarkt (MI) hos mus bruker permanent ligation av venstre fremre synkende (LAD) koronararterie15,16. Blant de forskjellige stammene av mus som brukes, har permanent LAD-ligation hos C57BL6-mus en akseptabel overlevelsesrate og presenterer vanligvis konsekvent ombygging og hjerteendringer etter MI16. I gnagermodeller har flere tilnærminger blitt beskrevet hvor hjertevev har blitt påført hjertet i jakten på effektiv regenerering av skadet myokardi4,6,17. Mens store dyr fortsatt representerer en mer klinisk relevant modell for å teste hjerte regenerativeegenskaper 5,14, gir allsidigheten og gjennomførbarheten til musemodellen seg til dette raske studieområdet. Dette kan unngå noen av fallgruvene som er typiske for store dyrestudier, inkludert (men ikke begrenset til): 1) høy dyredødelighet (med mindre diagonale koronararterier er ligated fører til uforutsigbarsegmentale infarkter14, eller den distale enden av LAD er okkludert etterfulgt av reperfusjon i stedet for permanent ligation5); 2) etiske problemer med relativt økt skade forårsaket av store dyreprotokoller sammenlignet med mus18; 3) økte kostnader og / eller mulighetsproblemer, for eksempel den relative utilgjengeligheten av stort dyreutstyr som MR-skannere14. Det er også viktig å vurdere at gitt den omfattende varigheten og engasjementet som er typisk for store dyrestudier, har de potensial til å bli utdaterte før de er ferdige, spesielt med den raske utviklingen som er typisk for dette feltet. For eksempel er det først nylig at den kritiske rollen som inflammatoriske celler og mediatorer spiller i å regulere hjerteregenerering har dukketopp 19,20. Videre har den kritiske rollen til prekliniske studier, som små dyremodeller, blitt fremhevet av en Lancet Commission som et viktig skritt for å få robust kunnskap før de går over til menneskeligeforsøk 21.
For å lette fremdriften i forståelsen av mekanismer og optimaliseringsforhold for patchbaserte hjerteregenereringsmetoder in vivo, presenterer vi en ny tilnærming som beskriver en “scoop and drape”-metode for å bruke en 3D-bioprinted alginat / gelatinhydrogelplastapp på overflaten av utfarende hjerter i C57BL6-mus. Målet med denne tilnærmingen er å gi en allsidig in vivo modell for å teste 3D bioprinted patcher som sannsynligvis vil være mulig i brede forskningssammenhenger for det raskt utviklende feltet for hjerteregenerering2. Denne metoden kan tilpasses testpatcher generert av ikke-bioprinting metoder, ulike hydrogeler og autologe eller allogene stamcelle-avledede celler i patcher in vivo. Imidlertid er detaljert vurdering av bioprinting, hydrogeler eller celletyper utenfor omfanget av denne studien som fokuserer på den kirurgiske transplantasjonsmetoden.
Fordelene med protokollen inkluderer at hjerteinfarkt og anvendelse av et biotrykt plaster utføres i en kirurgisk prosedyre som kan utføres raskt, med lett tilgjengelige, kostnadseffektive laboratorieverktøy og med relativt lav dødelighet. Det gir også vanligvis et høyere antall dyr enn store dyremodeller i et mindre rom, noe som tillater robust sammenligning av flere eksperimentelle grupper, spesielt nyttig for flere gruppesammenligning in vivo. På den annen side har denne protokollen ulempene som: 1) musemodellen er fjernere fra menneskelig hjertestørrelse, anatomi og fysiologi enn i store dyremodeller, og den oversetter ikke direkte til mennesker; 2) murine LAD grener proksimalt, med betydelig variasjon mellom individuelle mus, noe som fører til infarkt størrelse variabilitet (et problem som deles med store dyremodeller); 3) plasteret må påføres over hele den fremre hjerteoverflaten, noe som er mindre presist enn å påføre over et bestemt infarktområde; og 4) plasteret påføres umiddelbart på tidspunktet for MI (for menneskelig bruk er det sannsynlig å være mer klinisk nyttig å utvikle en patch for bruk på kronisk infarcted sviktende hjerte måneder etter den første MI14).
Likevel, hvis valgt hensiktsmessig i henhold til hypotesen som testes, kan denne protokollen gi kritiske in vivo-data raskt, med høye n tall, på en måte som er i samsvar med materialene, budsjettet og ekspertisen som er tilgjengelig i de fleste laboratorier. Sammenlignet med store dyremodeller, er det en in vivo modell som er allsidig nok til å tilpasse seg nye 3D bioprinting teknologier (for eksempel ved den relative enkel å utføre pilotstudier for å teste gjennomførbarhet og sikkerhet før du flytter til større dyremodeller). Det ville være godt egnet for forskere som ønsker å generere in vivo data effektivt og billig, kanskje kjører flere sammenligninger av 3D bioprinted patcher med ulike bioprinting parametere, celler eller hydrogeler i patcher. Det ville være spesielt nyttig for å teste interaksjoner av ulike blandinger av stamceller og stamcelle-avledede celler med hydrogeler in vivo uten overflødig sløse av dyre celleavstamninger eller andre materialer som kan oppstå hvis du bruker store flekker. Ved hjelp av en musemodell vil også lette testing av patcher som inneholder artskompatible mus-avledede celle- og stamcellelinjer eller menneskeavledede celler der ensartede mus med en bestemt immunmangel er ønskelig. I tillegg kan testing i genmodifiserte musestammer tillate forskere å isolere effekten av spesifikke gener på signalveier og i bestemte celletyper som er relevante for kardiovaskulær sykdom, som for øyeblikket ikke ville være mulig i en stor dyremodell.
Metoden gjør det mulig for operatøren å effektivt transplantere en bioprinted patch ved å bruke den på den episke overflaten av et infarcted musehjerte etter permanent LAD ligation. I denne mulighetsfokuserte metoden kan vi utføre denne prosedyren på åtte mus per arbeidsdag (inkludert fremstilling av rommet før og etterpå). En bioprinting kjøre som produserer åtte 1 cm2 patcher i brønner av seks-brønner plater tar 2-3 timer (inkludert forberedelsestid før og etter). Vi brukte steril innsiden av en kirurgisk skalpellpakke som scoop for vår patch, som er lett tilgjengelig og generelt legger minimal kostnad, ved hjelp av de naturlige klebende egenskapene til alginat / gelatinhydrogel patch for å drapere over den fremre infarkt overflaten av hjertet. Etter vår erfaring er protokollen for LAD ligation hos mus operatøravhengig og en lavere dødelighet på 28 dager kan oppnås med erfarne operatører spesialisert på en modell. Van den Borne et al.16 rapporterte at C57BL6 mus utgjør en 44% dødelighet etter permanent LAD ligation ved 28 dager uten bruk av en, som er høyere enn den øvre grensen på 30% som vi observerte med metoden.
Intubasjonstrinnet er kritisk, og i seg selv kan være en kilde til dødelighet for mus med mindre det utføres av en dyktig operatør. Det er gjort vanskelig på grunn av den lille størrelsen på luftrøret, og derfor er forstørrelsesglass slitt av operatøren for dette trinnet. Vi bruker injisert ketamin/xylazin samt inhalert isofluorane for induksjon av bedøvelse slik at musen er dypt bedøvet ved relativt lave doser av hvert legemiddel. Derfor er det ingen risiko for musen å våkne opp under dette intubasjonstrinnet, men den høye dødeligheten forbundet med høye enkeltdoser unngås. Atropin ble også gitt for å motvirke bivirkninger som bradykardi og hypersalivasjon. Bruken av en spotlight påføres eksternt lyser opp luftrøret internt slik at den er mer synlig og stemmebåndene må visualiseres åpning og lukking med musens respirasjonshastighet (vanligvis ~ 120 åndedrag per minutt). Det er viktig å plassere musen perfekt (det er derfor en hard overflate foretrekkes i stedet for en varmematte under musen for dette trinnet) med de to fortennene holdt av en loopet tråd og tungen trukket ekstremt forsiktig med stumpe tang / par slikkepotter for å åpne munnen og visualisere luftrøret. Når intubasjonen er fullført, må operatøren være forsiktig så du ikke løsner røret i overføringen fra innvindusområdet til operasjonssengen (som har en varmematte under den for å forhindre hypotermi). Når du kobler pusterøret til ventilatorapparatet, er det avgjørende å stabilisere røret med den ene hånden og koble ventilatorkretsen til den andre, slik at det er minimal bevegelse av pusterøret, for eksempel å skyve det dypere inn i luftrøret når du kobler ventilatorsegmentet av slangen.
I denne studien brukte vi alginat 4% (w / v) / gelatin 8% (w / v) i Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM). Alginat / gelatin hydrogeler er kjent for sin biokompatibilitet, lave kostnader og biomekaniske egenskaper gjør dem nyttige for 3D vev engineering strategier23. Disse hydrogelene kan kryssbindes ved mild gelasjon ved å legge til kalsiumioner, noe som gjør at viskositeten kan endres. Etter bioprinting brukte vi kalsiumklorid (CaCl2) 2% (w / v) i fosfatbufret saltvann (PBS) på patcher og deretter dyrket dem i DMEM i seks brønnplater i 7-14 dager før transplantering dem. Dette var det optimale vinduet etter patcher som inneholder hjerteceller begynte å slå i kultur, men før patcher begynte å gå i oppløsning. Mens CaCl2 kunne legges regelmessig gjennom post-bioprinting fasen for å redusere patch oppløsning, fant vi at iboende viskositet av hydrogel var tilstrekkelig for patcher å opprettholde sin struktur opp til transplantasjon med bare en startdose av CaCl2.
Metoden tillatt for vellykket transplantasjon uten suturer (som kan skade hjertet) eller lim (som kan blokkere grensesnittet mellom og hjertet). Fremtidige studier kan bekrefte hypotesen om at suturløs og limløs transplantasjon ikke negativt påvirker engraftment hos mus, da det er kritisk at plasteret ikke glir av hjertet eller forstyrrer lungene. Andre studier som vurderer engraftment av patcher i permanente LAD ligation modeller med patch-basert reparasjon3 har målt engrafted område (mm2) gjenværende med tid24, podet patch tykkelse (μm) remining med tid25, kvantifisering av transplanterte celler ved polymerasekjedereaksjon (PCR)26 eller bioluminescens foton utslippsfluks av merkede levende donorceller (et mål på fotoner som slippes ut per sekund som kan kvantifisere merkede transplanterte celler som overlever hos levende dyr over tid)27. Fremtidige studier kan bruke disse metodene til å vurdere om suturløs og limfri transplantasjon påvirker patch engraftment (samt strukturelle og funksjonelle effekter på verten myokardiet). Likevel, makrooskopisk etter 28 dager in vivo i våre immunkompetentmus, presenterte det fremre mediastinum variabelt fibrinous materiale og adhesjoner. Mekanismen for patch-basert hjerteregenerering kan være fra stimulering av vert makrofaginflammatoriske responser 19 eller utskilles immunologiskefaktorer 20 i stedet for numerisk celle etterfylling. Hvis betennelse spiller en positiv rolle, kan tilstedeværelsen av utenlandsk hydrogelmateriale være gunstig. Alternativt, for å redusere tilstedeværelsen av fremmedmateriale kan det være gunstig hvis hydrogelkomponenten går i oppløsning over tid. Faktisk bruker noen tilnærminger biomaterialer som støtter celler i utgangspunktet og deretter går i oppløsning, slik at barevev 28,29. Fremtidige studier for å fullt ut analysere patch engraftment og bedre forstå mekanismene bak patch-basert hjerteregenerering kan føre til optimalisert eksperimentell design før oversettelse til menneskelige studier2.
Samlet sett er denne protokollen sannsynligvis allment mulig og også egnet til å teste flere grupper av 3D bioprinted patcher, for eksempel med forskjellig mobilinnhold. Fremtidige retninger for denne metoden inkluderer bioprinting av patcher som inneholder avanserte hydrogeler som ikke tidligere er testet in vivo eller tester effekten av forskjellige autologe eller allogene stamcelleavledede celler, for optimalisering før de går videre til store dyremodeller.
The authors have nothing to disclose.
Med takk til Natalie Johnston for opptak av ikke-kirurgiske opptak og all videoredigering.
3-0 non-absorbable black braided treated silk | Ethicon | 232G | |
6-0, 24” (60 cm) Prolene (polypropylene) suture, blue monofilament | Ethicon | 8805H | |
7-0, 18” (45 cm) silk black braided | Ethicon | 768G | |
Adjustable stereo microscope with 6.4x magnification | Olympus | SZ 3060 STU1 | |
Anitisedan (atipamezole) | Zoetis | N/A | |
Atropine suplhate 0.6 mg, 1 mL vials, 10 pack | Symbion Pharmacy Services | ATRO S I2 | |
Bupivacaine, 20 mL, 5 vials | Baxter Heathcare | BUPI I C01 | |
Temvet (buprenorphine), 300 µg/mL, 10 mL bottle | Troy Laboratories | TEMV I 10 | |
Curved-tip forceps | Kent Scientific | INS650915-4 | Iris dressing forceps, 10 cm-long curved dressing forceps; 0.8 mm serrated tips; stainless steel. |
Dissecting scissors for cutting muscle/skin | Kent Scientific | INS600393-G | Dissecting scissors, straight, 10 cm long |
Endotracheal intubation kit | Kent Scientific | ETI-MSE | Including intubation catheter/tube (20 G), fibre-optic light source and dental spatula |
Fine scissors | Kent Scientific | INS600124 | McPherson-Vannas micro scissors, 8 cm long, straight, 0.1 mm tips, 5 mm blades; stainless steel. |
Lasix (furosemide) 20 mg, 2 mL, 5 pack | Sigma Company | LASI A 1 | |
Heat pad for animal recovery post-op | Passwell | PAD | Passwell Cosy Heat Pad for Animals – 26cm x 36cm; 10 Watts; Soft PVC Cover |
Ketamine 100 mg, 50 mL | CEVA Animal Heath | KETA I 1 | |
Needle holder | Kent Scientific | INS600137 | Castroviejo needle holder, serrated, 14 cm long, 1.2 mm jaws with lock |
PhysioSuite with MouseVent G500 automatic ventilator | Kent Scientific | PS-MVG | |
Puralube Vet Opthalmic Ointment (sterile occular lubricant) | Dechra | 17033-211-38 | |
Self-retaining toothed mouse retractor | Kent Scientific | INS600240 | ALM serrated self-retaining retractor, 7 cm long |
Straight forceps | Kent Scientific | INS650908-4 | Super fine dressing forceps, 12.5 cm Long, serrated tips, 0.35 x 0.10 mm; stainless steel. |
Surgical magnifying glasses | Kent Scientific | SL-001 | |
VetFlo vaporizer | Kent Scientific | VetFlo-1205S-M | |
Xylazine 100 mg, 50 mL | Randlab | XYLA I R01 |