Dit protocol is bedoeld om een 3D-bioprint patch te transplanteren op het epicardium van infarct muizen die hartfalen modelleren. Het bevat details met betrekking tot anesthesie, de chirurgische borstopening, permanente ligatie van de linker voorste aflopende (LAD) kransslagader en toepassing van een bioprinted patch op het infarct gebied van het hart.
Het testen van regeneratieve eigenschappen van 3D-bioprinte hartpleisters in vivo met behulp van murinemodellen van hartfalen via permanente linker voorste afdaling (LAD) ligatie is een uitdagende procedure en heeft een hoog sterftecijfer vanwege de aard ervan. We ontwikkelden een methode om bioprinted patches van cellen en hydrogels consequent te transplanteren op het epicardium van een infarct muishart om hun regeneratieve eigenschappen op een robuuste en haalbare manier te testen. Ten eerste wordt een diep verdoofde muis zorgvuldig geïntubeerd en geventileerd. Na de linker laterale thoracotomie (chirurgische opening van de borst), wordt de blootgestelde LAD permanent geligat en wordt de bioprinted patch getransplanteerd op het epicardium. De muis herstelt snel van de procedure na het sluiten van de borst. De voordelen van deze robuuste en snelle aanpak zijn onder meer een voorspeld sterftecijfer van 28 dagen tot 30% (lager dan de 44% die door andere studies wordt gerapporteerd met behulp van een vergelijkbaar model van permanente LAD-ligatie bij muizen). Bovendien is de in dit protocol beschreven aanpak veelzijdig en kan deze worden aangepast om bioprinted patches te testen met behulp van verschillende celtypen of hydrogels waar een groot aantal dieren nodig is om studies optimaal van stroom te laten zijn. Over het algemeen presenteren we dit als een voordelige aanpak die preklinische tests kan veranderen in toekomstige studies voor het gebied van cardiale regeneratie en weefseltechniek.
Een harttransplantatie is de gouden standaard behandeling voor patiënten met hartfalen in de eindfase, maar er is een tekort aan donororganen. Het vereist onderdrukking van het immuunsysteem om afstoting van ent te voorkomen en het sterftecijfer van één jaar iswereldwijd1. Daarom is er een lange tijd stimulans om het myocardium in preklinische diermodellen te regenereren met het oog op de vertaling naar menselijke proeven2,3,4,5,6,7,8,9. Recente vooruitgang in 3D bioprinting van stamcellen of stamcel-afgeleide hartcellen hebben de aandacht gekregen als een veelbelovende benadering om het myocardium2,3,9,,10,11,12te regenereren .
De eerste menselijke veiligheidsproeven die patches toepassen om het hart te regenereren zijn gemeld, met autologe beenmergmonnucleaire cellen opgehangen in collageen of embryonale stamcel-afgeleide hartvererver cellen in fibrine, getransplanteerd naar het epicardium7,8,13. Echter, voor een meer nauwkeurige, schaalbare, automatiseerbare en reproduceerbare methode, 3D bioprinting van geoptimaliseerde hydrogel patches worden toegepast op het epicardial oppervlak van het hart is een veelbelovende aanpak om het myocardium regenereren voor patiënten die anders een harttransplantatie2,,10,11,12zou moeten regenereren .
Voordat vertaling naar menselijke proeven kan plaatsvinden, zijn preklinische dierstudies nodig. Preklinische in vivo modellen die regeneratie van het myocardium nastreven, zijn gemeld bij varkens5, schapen14, ratten6 en muizen4. Een gemeenschappelijk model van hartinfarct (MI) bij muizen maakt gebruik van permanente ligatie van de linker voorste aflopende (LAD) kransslagader15,16. Onder de verschillende stammen van muizen gebruikt, permanente LAD ligatie in C57BL6 muizen heeft een aanvaardbare overlevingskans en meestal presenteert consistente remodellering en cardiale veranderingen na MI16. In knaagdiermodellen zijn verschillende benaderingen beschreven waarbij hartweefsel op het hart is aangebracht om een effectieve regeneratie van beschadigd myocardium4,6,17te bevorderen . Terwijl grote dieren nog steeds een meer klinisch relevant model zijn om cardiale regeneratieve eigenschappen te testen5,14,leent de veelzijdigheid en haalbaarheid van het muismodel zich voor dit snel bewegende studiegebied. Dit kan voorkomen dat sommige van de valkuilen die kenmerkend zijn voor grote dierstudies, met inbegrip van (maar niet beperkt tot): 1) hoge diersterfte (tenzij diagonale kransslagaders worden losgekoppeld, wat leidt tot onvoorspelbare segmentale infarcten14, of het distale uiteinde van de LAD wordt afgesloten gevolgd door reperfusie in plaats van permanente ligatie5); 2) ethische kwesties met de relatief toegenomen schade veroorzaakt door grote dierlijke protocollen in vergelijking met muizen18; 3) hogere kosten- en/of haalbaarheidsproblemen, bijvoorbeeld de relatieve onbeschikbaarheid van grote dierapparatuur zoals MRI-scanners14. Het is ook belangrijk om te overwegen dat gezien de uitgebreide duur en inzet die kenmerkend zijn voor grote dierstudies, ze het potentieel hebben om verouderd te raken voordat ze klaar zijn, vooral met de snelle ontwikkelingen die kenmerkend zijn voor dit gebied. Zo is bijvoorbeeld pas onlangs de cruciale rol van ontstekingscellen en bemiddelaars bij het reguleren van hartregeneratie ontstaan19,20. Bovendien is de cruciale rol van preklinische studies, zoals kleine diermodellen, door een Lancet-commissie als een essentiële stap benadrukt om robuuste kennis op te doen voordat het overgaat tot menselijke proeven21.
Om de vooruitgang in het begrijpen van mechanismen te vergemakkelijken en de omstandigheden voor patch-gebaseerde cardiale regeneratie benaderingen in vivo te vergemakkelijken, presenteren we een nieuwe aanpak die een ‘scoop and drape’ methode beschrijft om een 3D bioprinted alginaat / gelatine hydrogel patch patch toe te passen op het oppervlak van infarcted harten in C57BL6 muizen. Het doel van deze aanpak is om een veelzijdig in vivo model te bieden om 3D-bioprinted patches te testen die waarschijnlijk haalbaar zijn in brede onderzoekscontexten voor het snel evoluerende gebied van cardiale regeneratie2. Deze methode kan worden aangepast om patches te testen die worden gegenereerd door niet-bioprintmethoden, verschillende hydrogels en autologe of allogene stamcelcellen die afkomstig zijn van patches in vivo. Echter, gedetailleerde aandacht van bioprinting, hydrogels of celtypes valt buiten het bereik van deze studie die zich richt op de chirurgische transplantatie methode.
De voordelen van het protocol zijn onder meer dat het hartinfarct en de toepassing van een bioprinted patch worden uitgevoerd in één chirurgische ingreep die snel kan worden uitgevoerd, met direct beschikbare, kosteneffectieve laboratoriumgereedschappen en met een relatief laag sterftecijfer. Het maakt ook meestal een hoger aantal dieren dan grote dierlijke modellen in een kleinere ruimte, waardoor een robuuste vergelijking van meerdere experimentele groepen mogelijk is, met name handig voor meerdere groepsvergelijking in vivo. Aan de andere kant heeft dit protocol de nadelen dat: 1) het muismodel verder afstaat van menselijke hartgrootte, anatomie en fysiologie dan in grote diermodellen en het vertaalt zich niet direct in mensen; 2) de murine LAD takken proximally, met aanzienlijke variabiliteit tussen individuele muizen, wat leidt tot infarct grootte variabiliteit (een probleem gedeeld met grote dierlijke modellen); 3) de pleister moet over het gehele voorste hartoppervlak worden aangebracht, dat minder nauwkeurig is dan het aanbrengen van een specifiek infarctgebied; en 4) de patch wordt onmiddellijk toegepast op het moment van MI (voor menselijk gebruik is het waarschijnlijk meer klinisch nuttig om een patch te ontwikkelen voor toepassing op de chronisch infarct falende hart maanden na de eerste MI14).
Niettemin, indien correct gekozen volgens de hypothese wordt getest, dit protocol kan kritische in vivo gegevens snel, met hoge n nummers, op een manier die in overeenstemming is met de materialen, budget en expertise beschikbaar in de meeste laboratoria. In vergelijking met grote diermodellen is het een in vivo model dat veelzijdig genoeg is om zich aan te passen aan opkomende 3D-bioprintingtechnologieën (bijvoorbeeld door het relatieve gemak van het uitvoeren van proefstudies om haalbaarheid en veiligheid te testen voordat u overstapt op grotere diermodellen). Het zou zeer geschikt zijn voor onderzoekers die willen genereren in vivo gegevens efficiënt en goedkoop, misschien draait meerdere vergelijkingen van 3D bioprinted patches met verschillende bioprinting parameters, cellen of hydrogels in de patches. Het zou vooral nuttig zijn voor het testen van de interacties van verschillende mengsels van stamcellen en stamcel-afgeleide cellen met hydrogels in vivo zonder overmatig verspilling van dure cellijnen of andere materialen die kunnen optreden bij het gebruik van grootschalige patches. Het gebruik van een muismodel zou ook het testen van patches met soort-compatibele muis-afgeleide cel en stamcel afstammingen of mens-afgeleide cellen waar uniforme muizen met een specifiek immuuntekort wenselijk zijn. Bovendien zouden tests in genetisch gemodificeerde muizenstammen onderzoekers in staat kunnen stellen om de effecten van specifieke genen te isoleren op signaleringstrajecten en in specifieke celtypen die relevant zijn voor hart- en vaatziekten, wat momenteel niet mogelijk zou zijn in een groot diermodel.
De methode vergemakkelijkt de operator om een bioprinted patch efficiënt te transplanteren door deze toe te passen op het epicardiale oppervlak van een infarct muishart na permanente LAD ligatie. In deze haalbaarheidsgerichte methode zijn we in staat om deze procedure uit te voeren op acht muizen per werkdag (inclusief voorbereiding van de kamer voor en daarna). Een bioprinting run die acht 1 cm2 patches produceert in putten van zes-putplaten duurt 2-3 uur (inclusief voorbereidingstijd voor en na). We gebruikten de steriele binnenkant van een chirurgische scalpel pakket als de scoop voor onze patch, die gemakkelijk toegankelijk is en over het algemeen voegt minimale kosten, gebruik te maken van de natuurlijke lijm eigenschappen van de alginaat / gelatine hydrogel patch om de patch draperen over het voorste infarct oppervlak van het hart. In onze ervaring is het protocol voor LAD ligatie bij muizen afhankelijk van de operator en kan een lager sterftecijfer van 28 dagen worden bereikt met ervaren operators die gespecialiseerd zijn in één model. Van den Borne et al.16 rapporteerden dat C57BL6 muizen een sterfte van 44% vertonen na permanente LAD ligatie op 28 dagen zonder de toepassing van een patch, wat hoger is dan de bovengrens van 30% die we met de methode hebben waargenomen.
De intubatiestap is kritiek en op zich kan een bron van sterfte voor muizen zijn, tenzij deze wordt uitgevoerd door een ervaren operator. Het is moeilijk gemaakt vanwege de kleine omvang van de luchtpijp, dat is de reden waarom vergrootglazen worden gedragen door de exploitant voor deze stap. We gebruiken geïnjecteerde ketamine/xylazine en ingeademde isofluoraan voor inductie van verdoving, zodat de muis diep verdoofd is bij relatief lage doses van elk medicijn. Daarom is er geen risico voor de muis om wakker te worden tijdens deze intubatiestap, maar de hoge mortaliteit geassocieerd met hoge single-drug doses wordt vermeden. Atropine werd ook gegeven om bijwerkingen zoals bradycardie en hypersalivatie tegen te gaan. Het gebruik van een schijnwerper toegepast op de keel extern verlicht de luchtpijp intern, zodat het meer zichtbaar is en de stembanden moeten worden gevisualiseerd openen en sluiten met de luchtwegen van de muis (meestal ~ 120 ademhalingen per minuut). Het is van cruciaal belang om de muis perfect te positioneren (daarom heeft een hard oppervlak de voorkeur in plaats van een verwarmende mat onder de muis voor deze stap) met de twee snijtanden die door een lusdraad worden vastgehouden en de tong zich uiterst voorzichtig terugtrok met stompe tangen/paar spatels om de mond te openen en de luchtpijp te visualiseren. Zodra de intubatie is voltooid, moet de exploitant oppassen dat de buis in de overdracht van het intubatiegebied naar het bed niet loskomt (die wel een warmtemat eronder heeft om onderkoeling te voorkomen). Bij het aansluiten van de ademhalingsbuis op het ventilatorapparaat is het van cruciaal belang om de buis met de ene hand te stabiliseren en het ventilatorcircuit met de andere te verbinden, zodat er een minimale beweging van de ademhalingsbuis is, zoals het dieper in de luchtpijp duwen bij het aansluiten van het ventilatorsegment van de slang.
In deze studie gebruikten we alginaat 4% (w/v)/gelatine 8% (w/v) in Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM). Alginate/gelatine hydrogels staan bekend om hun biocompatibiliteit, lage kosten en biomechanische eigenschappen waardoor ze nuttig zijn voor 3D-weefsel engineering strategieën23. Deze hydrogels kunnen worden gekruist door milde gelatie door het toevoegen van calciumionen, die het mogelijk maakt voor viscositeit te veranderen. Na bioprinting hebben we calciumchloride (CaCl2) 2% (w/v) in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) op patches aangebracht en ze vervolgens gekweekt in DMEM in zes putplaten gedurende 7-14 dagen voordat ze worden getransplanteerd. Dit was het optimale venster na patches met hartcellen begon te kloppen in de cultuur, maar voordat patches begon te desintegreren. TerwijlCaCl 2 regelmatig kon worden toegevoegd in de post-bioprinting fase om patch desintegratie te verminderen, vonden we dat de intrinsieke viscositeit van de hydrogel voldoende was voor patches om hun structuur te behouden tot transplantatie met slechts een eerste dosis CaCl2.
De methode toegestaan voor een succesvolle transplantatie zonder hechtingen (die het hart kunnen beschadigen) of lijm (die de interface tussen de patch en het hart kan blokkeren). Toekomstige studies kunnen bevestigen de hypothese dat hechteloze en lijmloze transplantatie niet negatief invloed op engraftment in muizen als het is van cruciaal belang dat de patch niet glijden uit het hart of interfereren met de longen. Andere studies die de engraftment van patches in permanente LAD ligatiemodellen met patch-based reparatie3 beoordelen, hebben het geëntte gebied (mm2) gemeten dat overblijft met tijd24, de geënte patchdikte (μm) remining met tijd25, kwantificering van getransplanteerde cellen door polymerasekettingreactie (PCR)26 of bioluminescentiefotontiestroom van geëtiketteerde levende donorcellen (een maat voor per seconde uitgestoten fotonen die geëtiketteerde geënte cellen kunnen kwantificeren die in de loop van de tijd overleven bij levende dieren)27. Toekomstige studies kunnen deze methoden gebruiken om verder te evalueren of hechtloze en lijmloze transplantatie patch-engraftment beïnvloedt (evenals structurele en functionele effecten op het host myocardium). Niettemin, macroscopisch na 28 dagen in vivo in onze immunocompetent muizen, presenteerde het voorste mediastinum variabel fibrinous materiaal en verklevingen. Het mechanisme van patch-gebaseerde cardiale regeneratie kan worden van stimulatie van gastheer macrofaag ontstekingsreacties19 of uitgescheiden immunologische factoren20 in plaats van numerieke celaanvulling. Als ontsteking een positieve rol speelt, kan de aanwezigheid van vreemd hydrogelmateriaal gunstig zijn. Als alternatief, om de aanwezigheid van vreemd materiaal te verminderen kan het nuttig zijn als de hydrogel component uiteenvalt na verloop van tijd. In feite gebruiken sommige benaderingen biomaterialen die cellen in eerste instantie ondersteunen en vervolgens desintegreren, waardoor alleen weefsel28,29. Toekomstige studies om patch-engraftment volledig te analyseren en de mechanismen achter patch-gebaseerde cardiale regeneratie beter te begrijpen, kunnen leiden tot geoptimaliseerde experimentele ontwerpen voordat ze worden vertaald naar menselijke proeven2.
Over het algemeen is dit protocol waarschijnlijk op grote schaal haalbaar en ook geschikt voor het testen van meerdere groepen 3D-bioprinted patches, bijvoorbeeld met verschillende cellulaire inhoud. Toekomstige aanwijzingen voor deze methode omvatten het bioprinten van patches die geavanceerde hydrogels bevatten die niet eerder in vivo zijn getest of het testen van de effecten van verschillende autologe of allogene stamcelcellen, voor optimalisatie voordat ze overgaan tot grote diermodellen.
The authors have nothing to disclose.
Met dank aan Natalie Johnston voor de opname van de niet-chirurgische beelden en alle videobewerking.
3-0 non-absorbable black braided treated silk | Ethicon | 232G | |
6-0, 24” (60 cm) Prolene (polypropylene) suture, blue monofilament | Ethicon | 8805H | |
7-0, 18” (45 cm) silk black braided | Ethicon | 768G | |
Adjustable stereo microscope with 6.4x magnification | Olympus | SZ 3060 STU1 | |
Anitisedan (atipamezole) | Zoetis | N/A | |
Atropine suplhate 0.6 mg, 1 mL vials, 10 pack | Symbion Pharmacy Services | ATRO S I2 | |
Bupivacaine, 20 mL, 5 vials | Baxter Heathcare | BUPI I C01 | |
Temvet (buprenorphine), 300 µg/mL, 10 mL bottle | Troy Laboratories | TEMV I 10 | |
Curved-tip forceps | Kent Scientific | INS650915-4 | Iris dressing forceps, 10 cm-long curved dressing forceps; 0.8 mm serrated tips; stainless steel. |
Dissecting scissors for cutting muscle/skin | Kent Scientific | INS600393-G | Dissecting scissors, straight, 10 cm long |
Endotracheal intubation kit | Kent Scientific | ETI-MSE | Including intubation catheter/tube (20 G), fibre-optic light source and dental spatula |
Fine scissors | Kent Scientific | INS600124 | McPherson-Vannas micro scissors, 8 cm long, straight, 0.1 mm tips, 5 mm blades; stainless steel. |
Lasix (furosemide) 20 mg, 2 mL, 5 pack | Sigma Company | LASI A 1 | |
Heat pad for animal recovery post-op | Passwell | PAD | Passwell Cosy Heat Pad for Animals – 26cm x 36cm; 10 Watts; Soft PVC Cover |
Ketamine 100 mg, 50 mL | CEVA Animal Heath | KETA I 1 | |
Needle holder | Kent Scientific | INS600137 | Castroviejo needle holder, serrated, 14 cm long, 1.2 mm jaws with lock |
PhysioSuite with MouseVent G500 automatic ventilator | Kent Scientific | PS-MVG | |
Puralube Vet Opthalmic Ointment (sterile occular lubricant) | Dechra | 17033-211-38 | |
Self-retaining toothed mouse retractor | Kent Scientific | INS600240 | ALM serrated self-retaining retractor, 7 cm long |
Straight forceps | Kent Scientific | INS650908-4 | Super fine dressing forceps, 12.5 cm Long, serrated tips, 0.35 x 0.10 mm; stainless steel. |
Surgical magnifying glasses | Kent Scientific | SL-001 | |
VetFlo vaporizer | Kent Scientific | VetFlo-1205S-M | |
Xylazine 100 mg, 50 mL | Randlab | XYLA I R01 |