Detta protokoll syftar till att transplantera en 3D-bioprinted patch på epicardium av infarcted möss modellering hjärtsvikt. Den innehåller detaljer om anestesi, kirurgiska bröstet öppning, permanent ligering av vänster främre fallande (LAD) födans gatan och tillämpning av en bioprinted patch på infarcted området i hjärtat.
Testa regenerativa egenskaper hos 3D-biotryckta hjärtplåster in vivo med hjälp av murinmodeller av hjärtsvikt via permanent vänster främre fallande (LAD) ligering är ett utmanande förfarande och har en hög dödlighet på grund av sin natur. Vi utvecklade en metod för att konsekvent transplantera biotryckta fläckar av celler och hydrogeler på epikardiet av ett infarcted mushjärta för att testa deras regenerativa egenskaper på ett robust och genomförbart sätt. Först är en djupt sövd mus försiktigt intubated och ventilerad. Efter vänster laterala thoracotomy (kirurgiska öppnandet av bröstet), den exponerade LAD är permanent ligerade och bioprinted patch transplanteras på epicardium. Musen återhämtar sig snabbt från proceduren efter stängning av bröstet. Fördelarna med denna robusta och snabba metod inkluderar en förutspådd 28-dagars dödlighet på upp till 30% (lägre än de 44% som rapporterats av andra studier med hjälp av en liknande modell av permanent LAD-ligering hos möss). Dessutom är det tillvägagångssätt som beskrivs i detta protokoll mångsidigt och skulle kunna anpassas till att testa biotryckta plåster med hjälp av olika celltyper eller hydrogeler där ett stort antal djur behövs för att optimalt driva studier. Sammantaget presenterar vi detta som ett fördelaktigt tillvägagångssätt som kan ändra preklinisk testning i framtida studier för området hjärt regenerering och vävnad engineering.
En hjärttransplantation är den gyllene standarden behandling för patienter med slutstadiet hjärtsvikt men det finns en brist på givare organ. Det kräver immunsystemet dämpning för att förhindra transplantat avstötning och ett års dödlighet är 15% i hela världen1. Därför finns det ett långvarigt incitament att regenerera myokardiet i prekliniska djurmodeller i syfte att översätta till försökpå människa 2,3,4,5,6,7,8,9. De senaste framstegen inom 3D-bioprinting av stamceller eller stamceller-härledda hjärtceller har fått uppmärksamhet som en lovande strategi för att regenerera myokardiet2,3,9,10,11,12.
De första mänskliga säkerhetsprövningar tillämpa patchar för att regenerera hjärtat har rapporterats, med autolog benmärg mononukleära celler upphängda i kollagen eller embryonala stamceller-härledda hjärt stamceller stamceller i fibrin, transplanteras till epikarden7,8,13. Men för en mer exakt, skalbar, automatik och reproducerbar metod, 3D-bioprinting av optimerade hydrogel patchar som skall tillämpas på episslapsial yta i hjärtat är en lovande strategi för att regenerera myokardiet för patienter som annars skulle behöva en hjärttransplantation2,10,11,12.
Innan översättning till försök på människa kan ske behövs prekliniska djurstudier. Prekliniska in vivo-modeller som bedriver regenerering av hjärtmuskeln har rapporterats hosgrisar 5,får 14,råttor 6 och möss4. En vanlig modell av hjärtinfarkt (MI) hos möss använder permanent ligatur av vänster främre fallande (LAD) koronarkärl15,16. Bland de olika stammar av möss som används, permanent LAD ligering i C57BL6 möss har en acceptabel överlevnad och typiskt presenterar konsekvent ombyggnad och hjärt förändringar efter MI16. I gnagare modeller, flera tillvägagångssätt har beskrivits där hjärtvävnad har tillämpats på hjärtat i jakten på effektiv regenerering av skadade myokardium4,6,17. Medan stora djur fortfarande utgör en mer kliniskt relevant modell för att testa hjärt regenerativaegenskaper 5,14, mångsidigheten och genomförbarheten av musmodellen lämpar sig för detta snabbrörliga område av studien. Detta kan undvika några av de fallgropar som är typiska för stora djurstudier, inklusive (men inte begränsat till): 1) hög djurdödlighet (om inte diagonala kranskärl är ligerade vilket leder till oförutsägbara segmental infarcts14, eller den distala änden av LAD är ockluderas följt av reperfusion i stället för permanent ligation5); 2) etiska frågor med den relativt ökade skada som orsakas av stora djurprotokoll jämfört med möss18; 3) ökade kostnader och / eller genomförbarhetsfrågor, till exempel den relativa otillgängligheten av stora djurutrustning såsom MRI-skannrar14. Det är också viktigt att tänka på att med tanke på den omfattande varaktighet och engagemang som är typisk för stora djurstudier, har de potential att bli föråldrade innan de är färdiga, särskilt med den snabba utvecklingen som är typisk för detta område. Till exempel är det först nyligen som den kritiska roll som inflammatoriska celler och medlare i regleringen av hjärtregenerering har uppstått19,20. Dessutom har den kritiska roll som prekliniska studier, såsom små djurmodeller, har lyfts fram av en Lancet kommissionen som ett viktigt steg för att få robust kunskap innan de flyttar till mänskliga försök21.
För att underlätta framsteg i förståelse mekanismer och optimera villkoren för patch-baserade hjärt regenerering metoder in vivo, presenterar vi en ny metod som beskriver en “scoop och drapera” metod för att tillämpa en 3D-bioprinted alginatit/gelatin hydrogel patch på ytan av infarcted hjärtan i C57BL6 möss. Syftet med detta tillvägagångssätt är att tillhandahålla en mångsidig in vivo-modell för att testa 3D-biotryckta plåster som sannolikt är genomförbara i breda forskningssammanhang för det snabbt föränderliga området hjärtregenerering2. Denna metod skulle kunna anpassas till testplåster som genereras av icke-bioprinting metoder, olika hydrogels och autologa eller allergiframkallande stamceller-härledda celler inom plåster in vivo. Men detaljerad hänsyn till bioprinting, hydrogels eller celltyper är utanför ramen för denna studie som fokuserar på kirurgisk transplantation metoden.
Fördelarna med protokollet inkluderar att hjärtinfarkt och tillämpning av en bioprinted patch utförs i ett kirurgiskt ingrepp som kan utföras snabbt, med lättillgängliga, kostnadseffektiva laboratorieverktyg och med en relativt låg dödlighet. Det möjliggör också vanligtvis ett högre antal djur än stora djurmodeller i ett mindre utrymme, vilket möjliggör robust jämförelse av flera experimentella grupper, särskilt användbart för flera gruppjämförelse in vivo. Å andra sidan har detta protokoll de nackdelar som: 1) musmodellen är mer avlägsen från människans hjärta storlek, anatomi och fysiologi än i stora djurmodeller och det inte direkt översätta till människor; 2) den murine LAD grenar proximally, med betydande variabilitet mellan enskilda möss, vilket leder till infarct storlek variabilitet (ett problem som delas med stora djurmodeller); 3) plåstret måste appliceras över hela främre hjärtat yta, vilket är mindre exakt än att tillämpa över en specifik infarct område; och 4) plåstret appliceras omedelbart vid tidpunkten för MI (för humant bruk är det sannolikt att vara mer kliniskt användbart för att utveckla ett plåster för applicering på de kroniskt infarcted sviktande hjärtmånaderna efter den inledande MI14).
Icke desto mindre, om det väljs på lämpligt sätt enligt hypotesen testas, kan detta protokoll ge kritiska in vivo-data snabbt, med höga n-nummer, på ett sätt som är förenligt med material, budget och expertis som finns i de flesta laboratorier. Jämfört med stora djurmodeller är det en in vivo-modell som är tillräckligt mångsidig för att anpassa sig till nya 3D-bioprintingtekniker (till exempel genom den relativa lättheten att utföra pilotstudier för att testa genomförbarhet och säkerhet innan man går över till större djurmodeller). Det skulle vara väl lämpad för forskare som vill generera in vivo data effektivt och billigt, kanske kör flera jämförelser av 3D-biotryckta patchar med olika bioprinting parametrar, celler eller hydrogeler i plåstrna. Det skulle vara särskilt användbart för att testa interaktioner av olika blandningar av stamceller och stamceller-härledda celler med hydrogeler in vivo utan överskottssvinsage av dyra cell härstamningar eller andra material som kan uppstå om du använder storskaliga fläckar. Att använda en musmodell skulle också underlätta testning av plåster som innehåller artkompatibla celler och stamceller eller celler som härrör från människor, där enhetliga möss med en specifik immunbrist är önskvärda. Dessutom kan testning i genetiskt modifierade musstammar göra det möjligt för forskare att isolera effekterna av specifika gener på signalvägar och i specifika celltyper som är relevanta för hjärt-kärlsjukdom, vilket för närvarande inte skulle vara möjligt i en stor djurmodell.
Metoden underlättar för operatören att effektivt transplantera en bioprinted patch genom att applicera den på den epispiska ytan av en infarcted mus hjärta efter permanent LAD ligering. I denna genomförbarhetsfokuserade metod kan vi utföra denna procedur på åtta möss per arbetsdag (inklusive beredning av rummet före och efteråt). En bioprintingkörning som producerar åtta 1 cm2 plåster i brunnar av sex-brunnsplattor tar 2-3 timmar (inklusive tillredningstid före och efter). Vi använde den sterila insidan av en kirurgisk skalpell paket som skopa för vårt plåster, som är lättillgänglig och i allmänhet lägger minimal kostnad, utnyttja den naturliga självhäftande egenskaper alginat/gelatin hydrogel patch att drapera plåstret över den främre infarcted ytan av hjärtat. Enligt vår erfarenhet är protokollet för LAD-ligering hos möss operatörsberoende och en lägre dödlighet på 28 dagar kan uppnås med erfarna operatörer specialiserade på en modell. Van den Borne et al.16 rapporterade att C57BL6 möss presentera en 44% dödlighet efter permanent LAD ligering vid 28 dagar utan tillämpning av ett plåster, vilket är högre än den övre gränsen på 30% som vi observerade med metoden.
Intubationssteget är kritiskt och i sig kan vara en källa till dödlighet för möss om det inte utförs av en skicklig operatör. Det försvåras på grund av den lilla storleken på luftstrupen, varför förstoringsglas bärs av operatören för detta steg. Vi använder injicerade ketamin/xylazin samt inhalerade isofluoran för induktion av bedövningsmedel så att musen är djupt sövd vid relativt låga doser av varje läkemedel. Därför finns det ingen risk för musen att vakna upp under denna intubation steg men den höga dödligheten i samband med höga enstaka läkemedel doser undviks. Atropin gavs också för att motverka biverkningar såsom bradykardi och hypersalivation. Användningen av en spotlight appliceras på halsen externt lyser upp luftstrupen internt så det är mer synligt och stämbanden måste visualiseras öppning och stängning med musens andningsfrekvens (vanligtvis ~ 120 andetag per minut). Det är viktigt att placera musen perfekt (vilket är anledningen till en hård yta är att föredra snarare än en värmande matta under musen för detta steg) med de två framtänder tänder som innehas av en loopad tråd och tungan indragen extremt försiktigt med trubbiga tångar / par spatlar för att öppna munnen och visualisera luftstrupen. När intubationen är avslutad måste operatören vara försiktig så att röret inte rubbas i överföringen från intubationsområdet till operationssängen (som har en värmematta under den för att förhindra hypotermi). När andningsröret ansluts till ventilatorapparaten är det kritiskt att stabilisera röret med ena handen och ansluta ventilatorkretsen med den andra, så att det sker minimal rörelse hos andningsröret som att trycka in det djupare i luftstrupen när du ansluter slangens ventilatorsegment.
I denna studie använde vi alginat 4% (v/v)/gelatin 8% (w/v) i Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM). Alginat/gelatin hydrogels är kända för sin biokompatibilitet, låg kostnad och biomekaniska egenskaper vilket gör dem användbara för 3D vävnadstekniskastrategier 23. Dessa hydrogeler kan korsas av mild gelation genom att tillsätta kalciumjoner, vilket gör det möjligt att ändra viskositeten. Efter bioprinting applicerade vi kalciumklorid (CaCl 2 )2%(w/v) i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) på plåster och sedan odlade dem i DMEM i sex brunnsplattor i 7-14 dagar innan du transplanterar dem. Detta var det optimala fönstret efter patchar som innehåller hjärtceller började slå i kultur men innan patchar började upplösas. Medan CaCl2 kunde läggas till regelbundet under hela efter bioprinting fasen för att minska plåster sönderfall, fann vi att den inneboende viskositeten i hydrogel var tillräcklig för plåster för att behålla sin struktur upp till transplantation med endast en initial dos av CaCl2.
Den metod som tillåts för framgångsrik transplantation utan suturer (som kan skada hjärtat) eller lim (som kan blockera gränssnittet mellan plåstret och hjärtat). Framtida studier kan bekräfta hypotesen att suturlös och limlös transplantation inte negativt påverkar engraftment hos möss eftersom det är kritiskt att plåstret inte glider av hjärtat eller stör lungorna. Andra studier som bedömt engraftation av plåster i permanenta LAD-ligeringsmodeller med patchbaserad reparation3 har mätt engrafted area (mm2) kvar med tid24, den ympade plåstertjockleken (μm) reminering med tid25, kvantifiering av transplanterade celler genom polymeraskedjereaktion (PCR)26 eller bioluminescence fotone utsläpp flux av märkta levande givare celler (ett mått på fotoner som avges per sekund som kan kvantifiera märkta ympade celler överlevande i levande djur över tiden)27. Framtida studier kan använda dessa metoder för att ytterligare utvärdera om suturlös och limlös transplantation påverkar plåsterens engraftment (samt strukturella och funktionella effekter på värddopokardium). Icke desto mindre, macroscopically efter 28 dagar in vivo i våra immunkompetenta möss, de främre mediastinum fram variabel fibrinous material och adhesions. Mekanismen för patch-baserade hjärt regenerering kan vara från stimulering av värd makrofag inflammatoriska svar19 eller utsöndras immunologiskafaktorer 20 snarare än numerisk cell påfyllning. Om inflammation spelar en positiv roll, kan förekomsten av främmande hydrogelmaterial vara fördelaktigt. Alternativt, för att minska förekomsten av främmande material kan det vara fördelaktigt om hydrogelkomponenten sönderfaller över tiden. I själva verket, vissa metoder använder biomaterial som stöder celler initialt och sedan sönderfaller, lämnar endast vävnad28,29. Framtida studier för att fullt ut analysera patch engraftment och bättre förstå mekanismerna bakom patch-baserade hjärt regenerering kan leda till optimerad experimentell design före översättning till mänskliga försök2.
Sammantaget är detta protokoll sannolikt att vara allmänt genomförbart och även lämpade för att testa flera grupper av 3D bioprinted patchar, till exempel med olika cellulära innehåll. Framtida riktningar för denna metod inkluderar bioprinting av plåster som innehåller avancerade hydrogels som inte tidigare testats in vivo eller testa effekterna av olika autologa eller allergiframkallande stamceller-härledda celler, för optimering innan du fortsätter till stora djurmodeller.
The authors have nothing to disclose.
Med tack till Natalie Johnston för inspelningen av den icke-kirurgiska bilder och alla videoredigering.
3-0 non-absorbable black braided treated silk | Ethicon | 232G | |
6-0, 24” (60 cm) Prolene (polypropylene) suture, blue monofilament | Ethicon | 8805H | |
7-0, 18” (45 cm) silk black braided | Ethicon | 768G | |
Adjustable stereo microscope with 6.4x magnification | Olympus | SZ 3060 STU1 | |
Anitisedan (atipamezole) | Zoetis | N/A | |
Atropine suplhate 0.6 mg, 1 mL vials, 10 pack | Symbion Pharmacy Services | ATRO S I2 | |
Bupivacaine, 20 mL, 5 vials | Baxter Heathcare | BUPI I C01 | |
Temvet (buprenorphine), 300 µg/mL, 10 mL bottle | Troy Laboratories | TEMV I 10 | |
Curved-tip forceps | Kent Scientific | INS650915-4 | Iris dressing forceps, 10 cm-long curved dressing forceps; 0.8 mm serrated tips; stainless steel. |
Dissecting scissors for cutting muscle/skin | Kent Scientific | INS600393-G | Dissecting scissors, straight, 10 cm long |
Endotracheal intubation kit | Kent Scientific | ETI-MSE | Including intubation catheter/tube (20 G), fibre-optic light source and dental spatula |
Fine scissors | Kent Scientific | INS600124 | McPherson-Vannas micro scissors, 8 cm long, straight, 0.1 mm tips, 5 mm blades; stainless steel. |
Lasix (furosemide) 20 mg, 2 mL, 5 pack | Sigma Company | LASI A 1 | |
Heat pad for animal recovery post-op | Passwell | PAD | Passwell Cosy Heat Pad for Animals – 26cm x 36cm; 10 Watts; Soft PVC Cover |
Ketamine 100 mg, 50 mL | CEVA Animal Heath | KETA I 1 | |
Needle holder | Kent Scientific | INS600137 | Castroviejo needle holder, serrated, 14 cm long, 1.2 mm jaws with lock |
PhysioSuite with MouseVent G500 automatic ventilator | Kent Scientific | PS-MVG | |
Puralube Vet Opthalmic Ointment (sterile occular lubricant) | Dechra | 17033-211-38 | |
Self-retaining toothed mouse retractor | Kent Scientific | INS600240 | ALM serrated self-retaining retractor, 7 cm long |
Straight forceps | Kent Scientific | INS650908-4 | Super fine dressing forceps, 12.5 cm Long, serrated tips, 0.35 x 0.10 mm; stainless steel. |
Surgical magnifying glasses | Kent Scientific | SL-001 | |
VetFlo vaporizer | Kent Scientific | VetFlo-1205S-M | |
Xylazine 100 mg, 50 mL | Randlab | XYLA I R01 |