En Ex Vivo Choroid Spirende Assay af okulær mikrovaskulær angiogenese
Summary
Denne protokol præsenterer choroid spiring assay, en ex vivo model af mikrovaskulær spredning. Denne analyse kan bruges til at vurdere veje involveret i prolifererende choroidal mikro fartøjer og vurdere narkotika behandlinger ved hjælp af vilde type og genetisk modificerede musevæv.
Abstract
Patologisk choroidal angiogenese, en fremtrædende funktion af aldersrelateret makuladegeneration, fører til synsnedsættelse og blindhed. Endotelcelle (EF) spredningsanalyser ved hjælp af humane retinale mikrovaskulære endotelceller (HRMEC’ er) eller isolerede primære nethinde-EC’er anvendes i vid udstrækning in vitro-modeller til undersøgelse af retinal angiogenese. Men, isolere ren murine retinale endotelceller er teknisk udfordrende og retinale ECs kan have forskellige spredning svar end choroidal endotelceller og forskellige celle / celle interaktioner. En meget reproducerbar ex vivo choroidal spiring assay som en model af choroidal mikrovaskulær spredning blev udviklet. Denne model omfatter samspillet mellem choroid vaskulatur (EF, makrofager, pericytter) og retinale pigment epitel (RPE). Muse-RPE/choroid/scleral explants isoleres og inkuberes i vækstfaktorredrimeret basalmembranekstrakt (BME) (dag 0). Medium ændres hver anden dag og choroid spiring kvantificeres på dag 6. Billederne af individuelle choroid explant er taget med en omvendt fase mikroskop og spiring område kvantificeres ved hjælp af en semi-automatiseret makro plug-in til ImageJ software udviklet i dette laboratorium. Denne reproducerbare ex vivo choroidal spiringsanalyse kan anvendes til at vurdere forbindelser til potentiel behandling og til mikrovaskulær sygdomsforskning for at vurdere veje, der er involveret i choroidal mikrokarprolifeion ved hjælp af vildtype og genetisk modificeret musevæv.
Introduction
Choroidal angiogenese dysregulation er forbundet med neovaskulær aldersrelateret makuladegeneration (AMD)1. Den choroid er en mikrovaskulær seng til stede under retinale pigment epitel (RPE). Det er blevet påvist, at nedsat blodgennemstrømning i choroid er forbundet med progression af AMD2. Det indviklede forhold mellem vaskulær endotel, RPE, makrofager, pericytter og andre celler er ansvarlig for homøostaseafvævet3,4,5. Derfor er en reproducerbar analyse modellering choroidal mikromiljø er afgørende for studiet af neovaskulær AMD.
Ex vivo angiogenese analyser og in vitro endotel cellekulturer kan supplere undersøgelser af mikrovaskulær adfærd in vivo, til test af nye lægemidler og for undersøgelser af patogenese. Endotelceller såsom humane retinale mikrovaskulære endotelceller (HRMEC), Human Umbilical Vein Enothelial Cells (HUVEC), isolerede primære dyrs hjerne eller retinale ECs anvendes ofte i in vitro-undersøgelser til okulær angiogenese forskning6,7,8. Især HRMEC’er har været meget anvendt som model for in vitro choroidal neovaskulærisation (CNV)9 ved at vurdere endotelspredning, migration, rørformet dannelse og vaskulær lækage til vurdering afinterventioner 6,10. EC’er i kultur er imidlertid begrænset som en model af CNV på grund af manglende interaktioner med andre celletyper, der findes i choroid, og fordi de fleste EF, der anvendes i disse analyser, ikke stammer fra choroid. Mus choroidal ECs er vanskelige at isolere og vedligeholde i kulturen.
Den aorta ring assay er meget udbredt som en model af makro vaskulær spredning. Vaskulære spirer fra aorta explants omfatter ECs, pericytes og makrofager11. Den aorta ring assay modeller store fartøj angiogenese godt12,13,14. Men det har begrænsninger som en model af choroidal neovascularization som aorta ringe er en makrovaskulær væv mangler den karakteristiske choroidal mikrovaskulære miljø, og spirer fra store fartøjer kan afvige fra spirer fra kapillære netværk, der er involveret i mikrovaskulær patologi. For nylig offentliggjorde en gruppe en ex-vivo retinal analyse15,16. Selv om det er egnet til retinal neovaskulær sygdom, er det ikke så hensigtsmæssigt for choroidal neovascularization som set i AMD.
Den choroidal spirende assay ved hjælp af mus RPE, choroid, og scleral explanted væv blev udviklet til bedre model CNV. Vævet kan nemt isoleres fra mus (eller andre arter) øjne17. Denne analyse gør det muligt at reproducere pro- og anti-angiogene potentiale af farmakologiske forbindelser og evaluere den rolle, som specifikke veje i choroidal neovaskulærisering ved hjælp af væv fra genetisk modificerede mus ogkontrol 18. Denne choroidal spirende analyse er blevet refereret i mange efterfølgende publikationer9,10,18,19,20. Her er den metode, der er involveret i brugen af denne analyse er påvist.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den choroidal spirende assay hjælpemidler forskning i neovaskulær AMD9,10,18,19,20. Choroid explants kan isoleres fra mus samt rotter og mennesker17,21. Choroid explant omfatter EC’er, makrofager og pericytes17. I denne analyse samspillet mellem choroidal ECs og tilstødende c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbejdet blev støttet af Grants fra Manpei Suzuki Diabetic Foundation (YT), Boston Children’s Hospital OFD/BTREC/CTREC Faculty Career Development Grant, Boston Children’s Hospital Oftalmology Foundation, BCH Pilot Award, BCH Manton Center Fellowship og Little Giraffe Foundation (ZF), The German Research Foundation (DFG; til BC [CA1940/1-1]), NIH R24EY024868, EY017017, R01EY01717-13S1, EY030904-01, BCH IDDRC (1U54HD090255), Massachusetts Lions Eye Foundation (LEHS).
Materials
| AnaSed (Xylazine) | AKORN | 59339-110-20 | |
| Basal membrane extract (BME) Matrigel | BD Biosciences | 354230 | |
| Cell culture dish | NEST | 704001 | 10cm |
| Complete classic medium with serum and CultureBoost | Cell systems | 4Z0-500 | |
| Ethyl alcohol 200 Proof | Pharmco | 111000200 | use for 70% |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 06-666 | |
| Microscope | ZEISS | Axio Observer Z1 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO | 15140 | 10000 U/mL |
| Tissue culture plate (24-well) | Olympus | 25-107 | |
| VetaKet CIII (Ketamine) | AKORN | 59399-114-10 |
References
- Zarbin, M. A. Current concepts in the pathogenesis of age-related macular degeneration. Arch Ophthalmol. 122 (4), 598-614 (2004).
- Pemp, B., Schmetterer, L. Ocular blood flow in diabetes and age-related macular degeneration. Canadian Journal of Ophthalmology. 43 (3), 295-301 (2008).
- Murakami, Y., Ishikawa, K., Nakao, S., Sonoda, K. H. Innate immune response in retinal homeostasis and inflammatory disorders. Progress in Retinal and Eye Research. 74, 100778 (2020).
- Fu, Z., et al. Dyslipidemia in retinal metabolic disorders. EMBO Molecular Medicine. 11 (10), 10473 (2019).
- Daruich, A., et al. Mechanisms of macular edema: Beyond the surface. Progress in Retinal and Eye Research. 63, 20-68 (2018).
- Tomita, Y., et al. Long-Acting FGF21 Inhibits Retinal Vascular Leakage in In Vivo and In Vitro Models. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 21041188 (2020).
- Maisto, R., et al. ARPE-19-derived VEGF-containing exosomes promote neovascularization in HUVEC: the role of the melanocortin receptor 5. Cell Cycle. 18 (4), 413-424 (2019).
- Mazzoni, J., et al. The Wnt Inhibitor Apcdd1 Coordinates Vascular Remodeling and Barrier Maturation of Retinal Blood Vessels. Neuron. 96 (5), 1055-1069 (2017).
- Fu, Z., et al. Adiponectin Mediates Dietary Omega-3 Long-Chain Polyunsaturated Fatty Acid Protection Against Choroidal Neovascularization in Mice. Investigative Ophthalmology and Visual Sciences. 58 (10), 3862-3870 (2017).
- Gong, Y., et al. Cytochrome P450 Oxidase 2C Inhibition Adds to omega-3 Long-Chain Polyunsaturated Fatty Acids Protection Against Retinal and Choroidal Neovascularization. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 36 (9), 1919-1927 (2016).
- Nicosia, R. F., Zorzi, P., Ligresti, G., Morishita, A., Aplin, A. C. Paracrine regulation of angiogenesis by different cell types in the aorta ring model. International Journal of Developmental Biology. 55 (4-5), 447-453 (2011).
- Bellacen, K., Lewis, E. C. Aortic ring assay. Journal of Visulaized Experiments. (33), e1564 (2009).
- Masson, V. V., et al. Mouse Aortic Ring Assay: A New Approach of the Molecular Genetics of Angiogenesis. Biological Procedures Online. 4, 24-31 (2002).
- Katakia, Y. T., et al. Ex vivo model for studying endothelial tip cells: Revisiting the classical aortic-ring assay. Microvascular Research. 128, 103939 (2020).
- Rezzola, S., et al. In vitro and ex vivo retina angiogenesis assays. Angiogenesis. 17 (3), 429-442 (2014).
- Rezzola, S., et al. A novel ex vivo murine retina angiogenesis (EMRA) assay. Experimental Eye Research. 112, 51-56 (2013).
- Shao, Z., et al. Choroid sprouting assay: an ex vivo model of microvascular angiogenesis. PLoS One. 8 (7), 69552 (2013).
- Tomita, Y., et al. Free fatty acid receptor 4 activation protects against choroidal neovascularization in mice. Angiogenesis. 23, 385-394 (2020).
- Li, J., et al. Endothelial TWIST1 promotes pathological ocular angiogenesis. Investigative Ophthalmology and Vision Science. 55 (12), 8267-8277 (2014).
- Liu, C. H., et al. Endothelial microRNA-150 is an intrinsic suppressor of pathologic ocular neovascularization. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 112 (39), 12163-12168 (2015).
- Zhou, Q., et al. LncEGFL7OS regulates human angiogenesis by interacting with MAX at the EGFL7/miR-126 locus. Elife. 8, 40470 (2019).
- Kobayashi, S., Fukuta, M., Kontani, H., Yanagita, S., Kimura, I. A quantitative assay for angiogenesis of cultured choroidal tissues in streptozotocin-diabetic Wistar and spontaneously diabetic GK rats. Japanese Journal of Pharmacology. 78 (4), 471-478 (1998).
- Kobayashi, S., et al. Inhibitory effects of tetrandrine and related synthetic compounds on angiogenesis in streptozotocin-diabetic rodents. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 22 (4), 360-365 (1999).
- Kobayashi, S., Shinohara, H., Tsuneki, H., Nagai, R., Horiuchi, S. N(epsilon)-(carboxymethyl)lysine proliferated CD34(+) cells from rat choroidal explant in culture. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 27 (9), 1382-1387 (2004).
- Kobayashi, S., et al. Overproduction of N(epsilon)-(carboxymethyl)lysine-induced neovascularization in cultured choroidal explant of streptozotocin-diabetic rat. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 27 (10), 1565-1571 (2004).
- Bergers, G., Song, S. The role of pericytes in blood-vessel formation and maintenance. Neuro-Oncology. 7 (4), 452-464 (2005).
- Browning, A. C., Stewart, E. A., Amoaku, W. M. Reply to: Phenotypic plasticity of human umbilical vein endothelial cells. British Journal of Ophthalmology. 96 (9), 1275-1276 (2012).
